亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        時間分辨免疫熒光層析快速檢測水產(chǎn)品中高效氯氰菊酯方法的建立

        2018-08-24 07:15:24姜琳琳
        漁業(yè)研究 2018年4期
        關(guān)鍵詞:氯氰菊酯熒光

        姜琳琳,蘇 捷

        (福建省水產(chǎn)研究所,福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室,福建 廈門 361013)

        合成擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是有機磷和有機氯農(nóng)藥的替代品,在全球范圍內(nèi)占農(nóng)藥使用量的30%以上[1]。氯氰菊酯(CYP)又是擬除蟲菊酯中應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥,有研究表明氯氰菊酯在水系統(tǒng)中的濃度約0.01~0.10 μg/L[2-3]。氯氰菊酯可以在水產(chǎn)品中富集[4],干擾魚類的生殖周期,引起細胞膜過氧化指標(biāo)升高,損傷神經(jīng)細胞[5]。而如果人食用了富集氯氰菊酯的水產(chǎn)品,會引起免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[6-7]。因此對水產(chǎn)品中氯氰菊酯的監(jiān)測是必要的。

        目前針對氯氰菊酯的檢測主要有氣相色譜法(GC-ECD)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等技術(shù)方法[8-13]。這些檢測方法具有靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點,但是目前的檢測技術(shù)前處理復(fù)雜,耗時長,難以適應(yīng)檢測任務(wù)量大的工作。時間分辨免疫熒光層析檢測技術(shù)(TRFICA),是利用待測抗原與標(biāo)記銪(Eu)顆粒的抗體結(jié)合后通過毛細管作用沿著硝酸纖維膜層析,與層析試紙上包被檢測抗原及質(zhì)控二抗不同程度的結(jié)合,根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的熒光強度強弱及其比值,可以分析待測樣品中的抗原濃度。與常規(guī)檢測技術(shù)相比,時間分辨免疫熒光層析檢測方法省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟,具有操作簡單、適用于批量樣品的快速篩選檢測等優(yōu)勢。

        本研究通過Eu標(biāo)記氯氰菊酯類農(nóng)藥抗體,結(jié)合免疫層析技術(shù),開發(fā)時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡用于常用農(nóng)藥高效氯氰菊酯的檢測,通過精確度、穩(wěn)定性實驗,并與其它的檢測方法進行比對,為進一步開發(fā)應(yīng)用時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡檢測高效氯氰菊酯奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗儀器

        熒光讀卡儀(上海杰一公司,JY1501FS);旋渦混合器;冷凍離心機;噴金劃膜一體機(杰一,Bio-line);氣相色譜儀(安捷倫6890N);酶標(biāo)儀(Tecan m 200)。

        1.2 實驗材料

        南美白對蝦采自廈門市場;高效氯氰菊酯(4.5%,廣東真格生物);Eu標(biāo)記試劑盒(DELFIA);氯氰菊酯抗原和抗體由項目組研制。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 抗體的Eu標(biāo)記

        參考Eu標(biāo)記試劑盒的標(biāo)記方法對氯氰菊酯類農(nóng)藥抗體進行標(biāo)記。在包被有氯氰菊酯人工抗原的96孔板中分別加入稀釋倍數(shù)為100、200、400、800、1 600、3 200、6 400的標(biāo)記抗體,37℃孵育2 h,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗6次,扣干,用酶標(biāo)儀熒光模塊檢測熒光值,評價抗體的Eu標(biāo)記效果,激發(fā)波長310 nm,發(fā)射波長610 nm,延遲時間300 μs。

        1.3.2 氯氰菊酯免疫熒光層析檢測卡的制備[14]

        將玻璃纖維用噴金平臺系統(tǒng)以15 μL/cm將Eu標(biāo)記的氯氰菊酯類單克隆抗體噴在玻璃纖維上,37℃干燥2 h。用劃膜系統(tǒng)以1 μL/cm將氯氰菊酯類偶聯(lián)抗原(1 mg/mL)劃在硝酸纖維素膜上,即為檢測線; 在離檢測線4 mm處噴上羊抗鼠IgG(1 mg/mL),即為質(zhì)控線,37℃ 干燥2 h。取出一塊膠板,將噴有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜粘貼在中央?yún)^(qū): 分別將吸水紙和膠金墊粘貼于硝酸纖維素膜的上方和下方,兩者之間重疊約2 mm;再在結(jié)合墊的上方粘貼玻璃纖維作為樣本墊,組裝成免疫熒光層析快速檢測卡,如圖1所示。

        注:1-結(jié)合墊;2-檢測線T;3-質(zhì)控線C;4-吸水墊;5-樣品墊;6-硝酸纖維素膜;7-載體墊;8-卡式外殼;9-點樣窗口;10-檢測窗口。

        Notes:1- combination pad;2- detection line T;3- quality control line C;4- water absorbent pad;5- sample pad;6- nitrocellulose membrane;7- carrier pad;8- card shell;9-point window;10-detection window.

        1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

        取南美白對蝦肌肉組織,用高速勻漿機絞成糜,置于磨口具塞試劑瓶中。試樣于-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆?。將上述制得的樣品于室溫下自然解?在具塞試劑瓶中),準(zhǔn)確稱取7份5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織陰性樣品于15 mL的離心管中,分別添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品,加入正己烷-乙酸乙酯-丙酮(1∶2∶1,V/V/V)提取液15 mL后,漩渦震蕩儀上振蕩1 min,再超聲提取5 min(頻率 100 Hz)后2 000 r/min離心5 min。取上層有機相經(jīng)裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾至雞心瓶。重復(fù)提取一次,合并提取液于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。取10 mL乙腈溶液溶解旋干物后轉(zhuǎn)移至新的離心管中,并用5 mL乙腈溶液洗滌雞心瓶,將洗液合并至離心管中。向上述乙腈溶解物中加入15 mL乙腈飽和的石油醚,振蕩1 min,使其充分混勻?;旌弦河? 000 r/min 離心7 min,棄去上層石油醚后取乙腈層,將其于 40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解旋干物后,再溶解于0.9 mL PBS中,備用于檢測。分別取3滴添加到熒光檢測卡的樣品孔中,10 min后讀取熒光讀卡器中T線與C線的熒光響應(yīng)值,以檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)為縱坐標(biāo)(y),以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x),用ELISA Calc軟件進行四參數(shù)邏輯曲線擬合,獲得四參數(shù)擬合曲線和擬合方程y=f(x)。

        1.3.4 樣品檢測

        準(zhǔn)確稱取5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程中的檢測方法提取高效氯氰菊酯,用PBS溶解后,滴加到檢測卡的樣品孔中,根據(jù)檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)和四參數(shù)擬合方程y=f(x),可以計算出溶液中高效氯氰菊酯的濃度。

        1.3.5 氣相色譜檢測方法

        參考GB/T 5009.162—2008《動物性食品中有機氯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯農(nóng)藥多組分殘留量的測定》標(biāo)準(zhǔn)對樣品進行檢測。

        樣品前處理:稱取水產(chǎn)品肉樣5 g,選擇40 mL正己烷:丙酮(V/V,2∶1)混合溶液作為提取液,3 g中性氧化鋁作為凈化填料過柱凈化,用30 mL正己烷:丙酮(V/V,4∶1)混合溶液作為淋洗液,氮氣吹干,用正己烷定容,待上機。

        氣相色譜條件:安捷倫6890N型氣相色譜儀(配有ECD檢測器),HP-5(5%苯基甲基硅氧烷)毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。載氣為高純氮氣,流速1.0 mL/min;進樣口和檢測器的溫度分別為260℃ 、310℃ ;色譜柱升溫程序:初始溫度100℃,保持1 min,以10℃/min 升至285℃,保持5 min。恒流方式,不分流進樣,進樣量為1 μL。

        2 結(jié)果

        2.1 抗體的Eu標(biāo)記結(jié)果

        表1 Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體的熒光檢測結(jié)果

        對Eu標(biāo)記的氯氰菊酯抗體(1 mg/mL)稀釋不同倍數(shù)后,通過與包被有氯氰菊酯抗原的96孔板孵育反應(yīng),檢測的的熒光值分析如表1所示,其中y=Fx/F100。由表1可以看出標(biāo)記有Eu顆粒的菊酯抗體與96孔板上包被的抗原可以有效結(jié)合。對抗體稀釋倍數(shù)和熒光比值用ELISA Calc進行四參數(shù)擬合,擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D,其中A為1.11,B為 1.55,C為466.40,D為0.013,決定系數(shù)R2為0.995 0;擬合曲線如圖2所示。結(jié)果說明Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體的濃度與待測組和對照組的熒光比值呈相關(guān)性,Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體可以應(yīng)用于競爭法檢測未知抗原的濃度。

        2.2 氯氰菊酯熒光檢測卡的最低檢測限與檢測范圍

        根據(jù)1.3.2的方法,制備氯氰菊酯熒光檢測試紙,如圖3A所示。圖3A中的3條試紙分別為未加樣、添加0 ng/mL和128 ng/mL的熒光檢測試紙,從圖中可以看出未加樣時,Eu標(biāo)記的氯氰菊酯抗體在結(jié)合墊上,加樣品溶液時在吸水紙的作用下,通過毛細管作用沿著硝酸纖維素膜層析,當(dāng)樣品中沒有氯氰菊酯(-)時,Eu標(biāo)記的抗體與T線包被的人工抗原結(jié)合,T線熒值升高,C線熒光值降低;當(dāng)樣品中有氯氰菊酯(+)時,Eu標(biāo)記的抗體與C線包被的人工抗原結(jié)合,C線熒光值升高,T線熒光值降低。氯氰菊酯熒光檢測試紙按圖1的結(jié)構(gòu)組合成檢測卡,以方便使用。參考1.3.3的方法在對蝦樣品中添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)提取后定容至1 mL,獲得修正后的高效氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液(文中所有的高效氯氰菊酯濃度都是以修正后的濃度計算)。取標(biāo)準(zhǔn)溶液3滴,滴加到檢測卡的加樣孔,用熒光讀卡器掃描并讀取熒光數(shù)值比值,如表2所示。對標(biāo)準(zhǔn)品濃度和熒光比值用ELISA Calc進行四參數(shù)擬合,擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D,其中A為8.81,B為1.35,C為3.02,D為0.19,R2為0.999 0;擬合曲線如圖3B所示。通過做基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以減少基質(zhì)復(fù)雜成份對檢測的影響,減少誤差。將獲得的A、B、C、D四參數(shù)輸入到熒光讀卡器中,就可以通過熒光讀卡器檢測樣品中高效氯氰菊酯的濃度。

        表2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度與T/C值

        設(shè)y=f(x),差值百分比計算如公式(1)和公式(2)所示。

        公式(1)

        公式(2)

        F(x)的曲線圖如圖4A所示,由圖4A可以看出,隨著x值的增加,F(xiàn)(x)值逐漸減小,說明隨著x值的增加,f(x)變化減少,即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度下降,當(dāng)x<19.3時,F(xiàn)(x)>5%;G(x)的曲線圖如圖4B所示,由圖4B可以看出,隨著x值的增加,G(x)值逐漸增加,說明隨著x值的增加,f(x)變化增加,即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度增加,當(dāng)x>0.35時,G(x)>5%。

        根據(jù)G(x)公式計算的最低檢測限計算結(jié)果,分別在10份蝦肉樣品中添加0.35 ng的高效氯氰菊酯,經(jīng)提取后定容至1 mL,用熒光檢測卡檢測結(jié)果如表3所示。根據(jù)表3的結(jié)果可以看出當(dāng)對蝦樣品中添加有0.35 ng高效氯氰菊酯時,可以被熒光讀卡器檢出,相對誤差在0.5%~68.6%之間。因此根據(jù)實驗結(jié)果該檢測卡的最低檢測限約為0.35 ng/mL。當(dāng)濃度低于0.35 ng/mL時,樣品組的C/T值與空白組的更加接近,以致儀器有時無法檢測出具體數(shù)值。同理通過F(x)公式,可以計算出當(dāng)樣品中待測物濃度差異為1 ng/mL時,C/T差異大于5%時,x的范圍即為檢測范圍。因此熒光檢測卡的檢測范圍是1~19.3 ng/mL。

        表3 對蝦樣品中添加最低檢測限高效氯氰菊酯檢測結(jié)果

        2.3 氯氰菊酯檢測卡準(zhǔn)確度和精密度實驗

        由于氯氰菊酯檢測卡批間生產(chǎn)和批內(nèi)生產(chǎn)還存在生產(chǎn)上的誤差,為滿足檢測的要求,對生產(chǎn)的3批次檢測卡檢測的準(zhǔn)確度和精密度進行驗證。通??梢杂闷骄鄬φ`差(AARD)表示檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,用變異系數(shù)(CV)表示檢測結(jié)果的精密度。以檢測范圍的最低值1 ng/mL的2倍和4倍進行驗證實驗,結(jié)果如表4所示,由表4可以看出三批檢測卡的平均相對誤差在4.24%~8.66%之間,回收率在89.1%~109.1%之間,平均回收率為98.9%,檢測卡批內(nèi)變異系數(shù)在3.0%~8.6%之間,批間變異系數(shù)在4.8%~6.6%之間。

        表4 對蝦中氯氰菊酯檢測卡檢測的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

        以氣相色譜儀器的檢測結(jié)果為真值,則檢測結(jié)果相對誤差的計算如公式(3)所示,其中RE是代表相對誤差,R為氣相色譜儀器的檢測結(jié)果,R′是檢測卡檢測結(jié)果。

        公式(3)

        選用20個對蝦樣品,其中10個為陰性樣,檢測結(jié)果均為陰性;10個為隨機加標(biāo)樣(1~4 μg/kg),用檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果(氣相色譜法檢測限為1 ng/mL)如表5所示。檢測卡檢測結(jié)果相對誤差在8%~20%之間。對兩種檢測結(jié)果的相關(guān)性分析如圖5所示,檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果的線性方程為y=0.931 1x+0.045 4,相關(guān)系數(shù)R=0.989 9。結(jié)果說明氯氰菊酯檢測卡的檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果有良好線性相關(guān),可以應(yīng)用于對蝦中高效氯氰菊酯的檢測篩選工作。

        表5 檢測卡與氣相色譜方法檢測對蝦中的高效氯氰菊酯結(jié)果

        3 討論

        時間分辨免疫熒光分析(TR-FIA)檢測方法是在ELISA技術(shù)上發(fā)展起來的,由于Eu原子受激發(fā)后熒光壽命較長(1 ms),可以與本底受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光明顯分開,因此利用Eu顆粒替代辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體,結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)和帶有時間分辨熒光模塊的酶標(biāo)儀可以實現(xiàn)對抗原的高靈敏定量分析。如Aceti利用TR-FIA方法對人體血液中的HIV病毒進行分析,靈敏度達到100%[15];Liang Qianni等用TR-FIA方法分析鼻咽癌標(biāo)志物Barr病毒,檢測的線性范圍為0~30 Au/mL,檢出限為0.018 Au/mL[16];Hiroko等用TR-FIA方法檢測抗肺炎支原體(MP)IgM和IgG,最低檢測限IgM為0.5 BU/mL,IgG為0.2 μB/mL;Huang Yukun等結(jié)合多色時間分辨熒光傳感器實現(xiàn)檢測牛奶中的多種葡萄球菌腸毒素(A、B、C1)目的[17]。

        時間分辨免疫熒光層析技術(shù)是在時間分辨免疫熒光分析技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新的技術(shù),結(jié)合熒光讀卡器可以實現(xiàn)對樣品的快速的高靈敏度定量分析。利用該技術(shù)對枯萎病菌(PSS)進行分析,最低檢測限為103CFU/mL,比ELISA方法的最低檢測限低100倍[18]。采用時間分辨免疫熒光層析技術(shù)檢測小麥、玉米、大豆和水稻等中的赭曲霉毒素A(OTA),檢出限為1 μg/kg,與液相色譜檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R為0.985 4[19]。這些研究結(jié)果表明時間分辨免疫熒光層析技術(shù)無論是在檢測醫(yī)學(xué)還是在食品安全領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用空間。

        4.5%高效氯氰菊酯乳油主要含有高效反式異構(gòu)體(S 1R 3S和R 1S 3R)和高效順式異構(gòu)體(S 1R 3R和R 1S 3S),兩種高效體按4.5%的濃度配制而成[21]。這兩種高效異構(gòu)體如圖6A~D所示[20]。氯氰菊酯人工抗原是由3-間苯氧苯甲酸(結(jié)構(gòu)如圖6E所示)通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)獲得,制備的氯氰菊酯抗體可以與二苯醚結(jié)構(gòu)結(jié)合。高效氯氰菊酯都含有二苯醚結(jié)構(gòu),因此可以通過氯氰菊酯抗體檢測高效氯氰菊酯。在水產(chǎn)品的氯氰菊酯的殘留主要也是以圖6中的4種高效氯氰菊酯異構(gòu)體形式存在,所以本方法通過自制的氯氰菊酯抗體檢測水產(chǎn)品的高效氯氰菊酯總量。

        本研究通過Eu顆粒標(biāo)記氯氰菊酯抗體,研發(fā)針對高效氯氰菊酯檢測的時間分辨免疫熒光檢測卡,對高效氯氰菊酯的最低檢測限可以達到1 ng/mL或0.2 μg/kg,與邱明[22]等采用氣相色譜法(GC-ECD)檢測水產(chǎn)品中氯氰菊酯的最低檢測限一致,略高于國標(biāo)GB 29705—2013對水產(chǎn)品中氯氰菊酯的最低檢測限(1 μg/kg)。 通過與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果的相關(guān)性分析,本技術(shù)方法檢測結(jié)果符合預(yù)期要求。由于高效氯氰菊酯在農(nóng)業(yè)上的廣泛使用,使動植物中經(jīng)常會有高效氯氰菊酯的殘留,因此本技術(shù)方法在生態(tài)保護、食品安全等領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾拈_發(fā)應(yīng)用前景。

        4 結(jié)論

        本研究通過Eu顆粒標(biāo)記可以與二苯醚結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的氯氰菊酯抗體,研發(fā)針對水產(chǎn)品中高效氯氰菊酯檢測的熒光檢測卡,通過在對蝦樣品中添加高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品分析檢測卡的最低檢測限、準(zhǔn)確度、精確度等指標(biāo),研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯檢測卡的最低檢測限為0.35 ng/mL,檢測范圍是1~19.3 ng/mL,檢測卡的平均相對誤差在4.24%~8.66%之間,批內(nèi)變異系數(shù)在3.0%~8.6%之間,批間變異系數(shù)在4.8%~6.6%之間,檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)R=0.989 9。結(jié)果表明本技術(shù)方法可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中高效氯氰菊酯的快速定量檢測。

        猜你喜歡
        氯氰菊酯熒光
        干式熒光發(fā)光法在HBV感染診療中應(yīng)用價值
        5%氯氟醚菊酯·高效氟氯氰菊酯懸浮劑正相高效液相色譜分析
        歐盟擬修訂高效氯氟氰菊酯在芹菜、茴香和大米中的最大殘留限量
        食品與機械(2019年1期)2019-03-30 01:14:36
        高熒光量子產(chǎn)率BODIPY衍生物的熒光性能研究
        微生物共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的適宜條件
        亞臨界流體萃取技術(shù)在茶葉降低菊酯類農(nóng)殘方面的應(yīng)用
        氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及降解特性研究
        12%氯氰菊酯EW防治荔枝蝽蟓田間藥效試驗
        氯菊酯在有機溶劑中的光降解
        熒光增白劑及其安全性和環(huán)保性
        亚洲乱码中文字幕综合| 国产精品大片一区二区三区四区| 人妻免费一区二区三区免费| 久久www免费人成精品| 亚洲的天堂av无码| 欧美自拍视频在线| 国产精品一区成人亚洲| 亚洲在中文字幕乱码熟女| 国产乱码精品一区二区三区久久| 久久久久亚洲av成人无码| 亚洲精品国产综合一线久久| 国产一区二区丁香婷婷| 91九色国产老熟女视频| 又色又爽又高潮免费视频国产| 一本一本久久a久久精品综合| 亚洲午夜无码久久久久软件| 人妻露脸国语对白字幕| 中文字幕av久久亚洲精品| 免费人成视频在线| 亚洲成AⅤ人在线观看无码| 久久熟女精品—区二区蜜臀| 国产区女主播在线观看| 青草视频在线播放| 亚洲AV成人无码久久精品老人| 国产激情一区二区三区在线蜜臀 | 国产精品乱码在线观看| 无码成人AV在线一区二区| 放荡成熟人妻中文字幕| 激情综合丁香五月| 国产久视频国内精品999| 精品人妻夜夜爽一区二区| 亚洲视频一区二区免费看| 国产精品国三级国产av| 又污又爽又黄的网站| 在线观看一区二区女同| 少妇人妻无一区二区三区 | 国产精品欧美久久久久久日本一道 | 日韩狼人精品在线观看| 文字幕精品一区二区三区老狼 | 91av精品视频| 一区二区免费国产a在亚洲|