姜琳琳，蘇 捷

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

合成擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是有機磷和有機氯農(nóng)藥的替代品，在全球范圍內(nèi)占農(nóng)藥使用量的30%以上[1]。氯氰菊酯(CYP)又是擬除蟲菊酯中應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥，有研究表明氯氰菊酯在水系統(tǒng)中的濃度約0.01～0.10 μg/L[2-3]。氯氰菊酯可以在水產(chǎn)品中富集[4]，干擾魚類的生殖周期，引起細胞膜過氧化指標(biāo)升高，損傷神經(jīng)細胞[5]。而如果人食用了富集氯氰菊酯的水產(chǎn)品，會引起免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[6-7]。因此對水產(chǎn)品中氯氰菊酯的監(jiān)測是必要的。

目前針對氯氰菊酯的檢測主要有氣相色譜法(GC-ECD)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等技術(shù)方法[8-13]。這些檢測方法具有靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，但是目前的檢測技術(shù)前處理復(fù)雜，耗時長，難以適應(yīng)檢測任務(wù)量大的工作。時間分辨免疫熒光層析檢測技術(shù)(TRFICA)，是利用待測抗原與標(biāo)記銪(Eu)顆粒的抗體結(jié)合后通過毛細管作用沿著硝酸纖維膜層析，與層析試紙上包被檢測抗原及質(zhì)控二抗不同程度的結(jié)合，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的熒光強度強弱及其比值，可以分析待測樣品中的抗原濃度。與常規(guī)檢測技術(shù)相比，時間分辨免疫熒光層析檢測方法省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，具有操作簡單、適用于批量樣品的快速篩選檢測等優(yōu)勢。

本研究通過Eu標(biāo)記氯氰菊酯類農(nóng)藥抗體，結(jié)合免疫層析技術(shù)，開發(fā)時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡用于常用農(nóng)藥高效氯氰菊酯的檢測，通過精確度、穩(wěn)定性實驗，并與其它的檢測方法進行比對，為進一步開發(fā)應(yīng)用時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡檢測高效氯氰菊酯奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

熒光讀卡儀(上海杰一公司，JY1501FS)；旋渦混合器；冷凍離心機；噴金劃膜一體機(杰一，Bio-line)；氣相色譜儀(安捷倫6890N)；酶標(biāo)儀(Tecan m 200)。

1.2 實驗材料

南美白對蝦采自廈門市場；高效氯氰菊酯(4.5%，廣東真格生物)；Eu標(biāo)記試劑盒(DELFIA)；氯氰菊酯抗原和抗體由項目組研制。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗體的Eu標(biāo)記

參考Eu標(biāo)記試劑盒的標(biāo)記方法對氯氰菊酯類農(nóng)藥抗體進行標(biāo)記。在包被有氯氰菊酯人工抗原的96孔板中分別加入稀釋倍數(shù)為100、200、400、800、1 600、3 200、6 400的標(biāo)記抗體，37℃孵育2 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗6次，扣干，用酶標(biāo)儀熒光模塊檢測熒光值，評價抗體的Eu標(biāo)記效果，激發(fā)波長310 nm，發(fā)射波長610 nm，延遲時間300 μs。

1.3.2 氯氰菊酯免疫熒光層析檢測卡的制備[14]

將玻璃纖維用噴金平臺系統(tǒng)以15 μL/cm將Eu標(biāo)記的氯氰菊酯類單克隆抗體噴在玻璃纖維上，37℃干燥2 h。用劃膜系統(tǒng)以1 μL/cm將氯氰菊酯類偶聯(lián)抗原(1 mg/mL)劃在硝酸纖維素膜上，即為檢測線； 在離檢測線4 mm處噴上羊抗鼠IgG(1 mg/mL)，即為質(zhì)控線，37℃ 干燥2 h。取出一塊膠板，將噴有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜粘貼在中央?yún)^(qū)： 分別將吸水紙和膠金墊粘貼于硝酸纖維素膜的上方和下方，兩者之間重疊約2 mm；再在結(jié)合墊的上方粘貼玻璃纖維作為樣本墊，組裝成免疫熒光層析快速檢測卡，如圖1所示。

注：1-結(jié)合墊；2-檢測線T；3-質(zhì)控線C；4-吸水墊；5-樣品墊；6-硝酸纖維素膜；7-載體墊；8-卡式外殼；9-點樣窗口；10-檢測窗口。

Notes：1- combination pad；2- detection line T；3- quality control line C；4- water absorbent pad；5- sample pad；6- nitrocellulose membrane；7- carrier pad；8- card shell；9-point window；10-detection window.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取南美白對蝦肌肉組織，用高速勻漿機絞成糜，置于磨口具塞試劑瓶中。試樣于-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆?。將上述制得的樣品于室溫下自然解?在具塞試劑瓶中)，準(zhǔn)確稱取7份5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織陰性樣品于15 mL的離心管中，分別添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，加入正己烷-乙酸乙酯-丙酮(1∶2∶1，V/V/V)提取液15 mL后，漩渦震蕩儀上振蕩1 min，再超聲提取5 min(頻率 100 Hz)后2 000 r/min離心5 min。取上層有機相經(jīng)裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾至雞心瓶。重復(fù)提取一次，合并提取液于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。取10 mL乙腈溶液溶解旋干物后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并用5 mL乙腈溶液洗滌雞心瓶，將洗液合并至離心管中。向上述乙腈溶解物中加入15 mL乙腈飽和的石油醚，振蕩1 min，使其充分混勻?；旌弦河? 000 r/min 離心7 min，棄去上層石油醚后取乙腈層，將其于 40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解旋干物后，再溶解于0.9 mL PBS中，備用于檢測。分別取3滴添加到熒光檢測卡的樣品孔中，10 min后讀取熒光讀卡器中T線與C線的熒光響應(yīng)值，以檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，用ELISA Calc軟件進行四參數(shù)邏輯曲線擬合，獲得四參數(shù)擬合曲線和擬合方程y=f(x)。

1.3.4 樣品檢測

準(zhǔn)確稱取5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程中的檢測方法提取高效氯氰菊酯，用PBS溶解后，滴加到檢測卡的樣品孔中，根據(jù)檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)和四參數(shù)擬合方程y=f(x)，可以計算出溶液中高效氯氰菊酯的濃度。

1.3.5 氣相色譜檢測方法

參考GB/T 5009.162—2008《動物性食品中有機氯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯農(nóng)藥多組分殘留量的測定》標(biāo)準(zhǔn)對樣品進行檢測。

樣品前處理：稱取水產(chǎn)品肉樣5 g，選擇40 mL正己烷：丙酮(V/V，2∶1)混合溶液作為提取液，3 g中性氧化鋁作為凈化填料過柱凈化，用30 mL正己烷：丙酮(V/V，4∶1)混合溶液作為淋洗液，氮氣吹干，用正己烷定容，待上機。

氣相色譜條件：安捷倫6890N型氣相色譜儀(配有ECD檢測器)，HP-5(5%苯基甲基硅氧烷)毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。載氣為高純氮氣，流速1.0 mL/min；進樣口和檢測器的溫度分別為260℃ 、310℃ ；色譜柱升溫程序：初始溫度100℃，保持1 min，以10℃/min 升至285℃，保持5 min。恒流方式，不分流進樣，進樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 抗體的Eu標(biāo)記結(jié)果

表1 Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體的熒光檢測結(jié)果

對Eu標(biāo)記的氯氰菊酯抗體(1 mg/mL)稀釋不同倍數(shù)后，通過與包被有氯氰菊酯抗原的96孔板孵育反應(yīng)，檢測的的熒光值分析如表1所示，其中y=Fx/F100。由表1可以看出標(biāo)記有Eu顆粒的菊酯抗體與96孔板上包被的抗原可以有效結(jié)合。對抗體稀釋倍數(shù)和熒光比值用ELISA Calc進行四參數(shù)擬合，擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A為1.11，B為 1.55，C為466.40，D為0.013，決定系數(shù)R2為0.995 0；擬合曲線如圖2所示。結(jié)果說明Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體的濃度與待測組和對照組的熒光比值呈相關(guān)性，Eu標(biāo)記氯氰菊酯抗體可以應(yīng)用于競爭法檢測未知抗原的濃度。

2.2 氯氰菊酯熒光檢測卡的最低檢測限與檢測范圍

根據(jù)1.3.2的方法，制備氯氰菊酯熒光檢測試紙，如圖3A所示。圖3A中的3條試紙分別為未加樣、添加0 ng/mL和128 ng/mL的熒光檢測試紙，從圖中可以看出未加樣時，Eu標(biāo)記的氯氰菊酯抗體在結(jié)合墊上，加樣品溶液時在吸水紙的作用下，通過毛細管作用沿著硝酸纖維素膜層析，當(dāng)樣品中沒有氯氰菊酯(-)時，Eu標(biāo)記的抗體與T線包被的人工抗原結(jié)合，T線熒值升高，C線熒光值降低；當(dāng)樣品中有氯氰菊酯(+)時，Eu標(biāo)記的抗體與C線包被的人工抗原結(jié)合，C線熒光值升高，T線熒光值降低。氯氰菊酯熒光檢測試紙按圖1的結(jié)構(gòu)組合成檢測卡，以方便使用。參考1.3.3的方法在對蝦樣品中添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)提取后定容至1 mL，獲得修正后的高效氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液(文中所有的高效氯氰菊酯濃度都是以修正后的濃度計算)。取標(biāo)準(zhǔn)溶液3滴，滴加到檢測卡的加樣孔，用熒光讀卡器掃描并讀取熒光數(shù)值比值，如表2所示。對標(biāo)準(zhǔn)品濃度和熒光比值用ELISA Calc進行四參數(shù)擬合，擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A為8.81，B為1.35，C為3.02，D為0.19，R2為0.999 0；擬合曲線如圖3B所示。通過做基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以減少基質(zhì)復(fù)雜成份對檢測的影響，減少誤差。將獲得的A、B、C、D四參數(shù)輸入到熒光讀卡器中，就可以通過熒光讀卡器檢測樣品中高效氯氰菊酯的濃度。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度與T/C值

設(shè)y=f(x)，差值百分比計算如公式(1)和公式(2)所示。

公式(1)

公式(2)

F(x)的曲線圖如圖4A所示，由圖4A可以看出，隨著x值的增加，F(xiàn)(x)值逐漸減小，說明隨著x值的增加，f(x)變化減少，即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度下降，當(dāng)x<19.3時，F(xiàn)(x)>5%；G(x)的曲線圖如圖4B所示，由圖4B可以看出，隨著x值的增加，G(x)值逐漸增加，說明隨著x值的增加，f(x)變化增加，即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度增加，當(dāng)x>0.35時，G(x)>5%。

根據(jù)G(x)公式計算的最低檢測限計算結(jié)果，分別在10份蝦肉樣品中添加0.35 ng的高效氯氰菊酯，經(jīng)提取后定容至1 mL，用熒光檢測卡檢測結(jié)果如表3所示。根據(jù)表3的結(jié)果可以看出當(dāng)對蝦樣品中添加有0.35 ng高效氯氰菊酯時，可以被熒光讀卡器檢出，相對誤差在0.5%～68.6%之間。因此根據(jù)實驗結(jié)果該檢測卡的最低檢測限約為0.35 ng/mL。當(dāng)濃度低于0.35 ng/mL時，樣品組的C/T值與空白組的更加接近，以致儀器有時無法檢測出具體數(shù)值。同理通過F(x)公式，可以計算出當(dāng)樣品中待測物濃度差異為1 ng/mL時，C/T差異大于5%時，x的范圍即為檢測范圍。因此熒光檢測卡的檢測范圍是1～19.3 ng/mL。

表3 對蝦樣品中添加最低檢測限高效氯氰菊酯檢測結(jié)果

2.3 氯氰菊酯檢測卡準(zhǔn)確度和精密度實驗

由于氯氰菊酯檢測卡批間生產(chǎn)和批內(nèi)生產(chǎn)還存在生產(chǎn)上的誤差，為滿足檢測的要求，對生產(chǎn)的3批次檢測卡檢測的準(zhǔn)確度和精密度進行驗證。通?？梢杂闷骄鄬φ`差(AARD)表示檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，用變異系數(shù)(CV)表示檢測結(jié)果的精密度。以檢測范圍的最低值1 ng/mL的2倍和4倍進行驗證實驗，結(jié)果如表4所示，由表4可以看出三批檢測卡的平均相對誤差在4.24%～8.66%之間，回收率在89.1%～109.1%之間，平均回收率為98.9%，檢測卡批內(nèi)變異系數(shù)在3.0%～8.6%之間，批間變異系數(shù)在4.8%～6.6%之間。

表4 對蝦中氯氰菊酯檢測卡檢測的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

以氣相色譜儀器的檢測結(jié)果為真值，則檢測結(jié)果相對誤差的計算如公式(3)所示，其中RE是代表相對誤差，R為氣相色譜儀器的檢測結(jié)果，R′是檢測卡檢測結(jié)果。

公式(3)

選用20個對蝦樣品，其中10個為陰性樣，檢測結(jié)果均為陰性；10個為隨機加標(biāo)樣(1～4 μg/kg)，用檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果(氣相色譜法檢測限為1 ng/mL)如表5所示。檢測卡檢測結(jié)果相對誤差在8%～20%之間。對兩種檢測結(jié)果的相關(guān)性分析如圖5所示，檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果的線性方程為y=0.931 1x+0.045 4，相關(guān)系數(shù)R=0.989 9。結(jié)果說明氯氰菊酯檢測卡的檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果有良好線性相關(guān)，可以應(yīng)用于對蝦中高效氯氰菊酯的檢測篩選工作。

表5 檢測卡與氣相色譜方法檢測對蝦中的高效氯氰菊酯結(jié)果

3 討論

時間分辨免疫熒光分析(TR-FIA)檢測方法是在ELISA技術(shù)上發(fā)展起來的，由于Eu原子受激發(fā)后熒光壽命較長(1 ms)，可以與本底受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光明顯分開，因此利用Eu顆粒替代辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)和帶有時間分辨熒光模塊的酶標(biāo)儀可以實現(xiàn)對抗原的高靈敏定量分析。如Aceti利用TR-FIA方法對人體血液中的HIV病毒進行分析，靈敏度達到100%[15]；Liang Qianni等用TR-FIA方法分析鼻咽癌標(biāo)志物Barr病毒，檢測的線性范圍為0～30 Au/mL，檢出限為0.018 Au/mL[16]；Hiroko等用TR-FIA方法檢測抗肺炎支原體(MP)IgM和IgG，最低檢測限IgM為0.5 BU/mL，IgG為0.2 μB/mL；Huang Yukun等結(jié)合多色時間分辨熒光傳感器實現(xiàn)檢測牛奶中的多種葡萄球菌腸毒素(A、B、C1)目的[17]。

時間分辨免疫熒光層析技術(shù)是在時間分辨免疫熒光分析技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新的技術(shù)，結(jié)合熒光讀卡器可以實現(xiàn)對樣品的快速的高靈敏度定量分析。利用該技術(shù)對枯萎病菌(PSS)進行分析，最低檢測限為103CFU/mL，比ELISA方法的最低檢測限低100倍[18]。采用時間分辨免疫熒光層析技術(shù)檢測小麥、玉米、大豆和水稻等中的赭曲霉毒素A(OTA)，檢出限為1 μg/kg，與液相色譜檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R為0.985 4[19]。這些研究結(jié)果表明時間分辨免疫熒光層析技術(shù)無論是在檢測醫(yī)學(xué)還是在食品安全領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用空間。

4.5%高效氯氰菊酯乳油主要含有高效反式異構(gòu)體(S 1R 3S和R 1S 3R)和高效順式異構(gòu)體(S 1R 3R和R 1S 3S)，兩種高效體按4.5%的濃度配制而成[21]。這兩種高效異構(gòu)體如圖6A～D所示[20]。氯氰菊酯人工抗原是由3-間苯氧苯甲酸(結(jié)構(gòu)如圖6E所示)通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)獲得，制備的氯氰菊酯抗體可以與二苯醚結(jié)構(gòu)結(jié)合。高效氯氰菊酯都含有二苯醚結(jié)構(gòu)，因此可以通過氯氰菊酯抗體檢測高效氯氰菊酯。在水產(chǎn)品的氯氰菊酯的殘留主要也是以圖6中的4種高效氯氰菊酯異構(gòu)體形式存在，所以本方法通過自制的氯氰菊酯抗體檢測水產(chǎn)品的高效氯氰菊酯總量。

本研究通過Eu顆粒標(biāo)記氯氰菊酯抗體，研發(fā)針對高效氯氰菊酯檢測的時間分辨免疫熒光檢測卡，對高效氯氰菊酯的最低檢測限可以達到1 ng/mL或0.2 μg/kg，與邱明[22]等采用氣相色譜法(GC-ECD)檢測水產(chǎn)品中氯氰菊酯的最低檢測限一致，略高于國標(biāo)GB 29705—2013對水產(chǎn)品中氯氰菊酯的最低檢測限(1 μg/kg)。 通過與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果的相關(guān)性分析，本技術(shù)方法檢測結(jié)果符合預(yù)期要求。由于高效氯氰菊酯在農(nóng)業(yè)上的廣泛使用，使動植物中經(jīng)常會有高效氯氰菊酯的殘留，因此本技術(shù)方法在生態(tài)保護、食品安全等領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾拈_發(fā)應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究通過Eu顆粒標(biāo)記可以與二苯醚結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的氯氰菊酯抗體，研發(fā)針對水產(chǎn)品中高效氯氰菊酯檢測的熒光檢測卡，通過在對蝦樣品中添加高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品分析檢測卡的最低檢測限、準(zhǔn)確度、精確度等指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯檢測卡的最低檢測限為0.35 ng/mL，檢測范圍是1～19.3 ng/mL，檢測卡的平均相對誤差在4.24%～8.66%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在3.0%～8.6%之間，批間變異系數(shù)在4.8%～6.6%之間，檢測卡檢測結(jié)果與氣相色譜檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)R=0.989 9。結(jié)果表明本技術(shù)方法可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中高效氯氰菊酯的快速定量檢測。