林功師

(廈門市海洋與漁業(yè)研究所，福建 廈門 361008)

孔雀石綠(Malachite green，MG)，學(xué)名為四甲基代二氨基三苯甲烷，是一類人工合成的三苯基甲烷類堿性染料，工業(yè)上常用于紙張、絲綢和皮革的染色[1]；在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用于預(yù)防和治療各類水生動(dòng)物病害，特別是魚(yú)類的小瓜蟲(chóng)病、鰓霉病和水霉病等[2]。因孔雀石綠在治療水霉病方面具有很好的作用，而曾常用在水產(chǎn)養(yǎng)殖、水產(chǎn)品的運(yùn)輸和水產(chǎn)品暫養(yǎng)等過(guò)程，以延長(zhǎng)水產(chǎn)品特別是魚(yú)類的存活時(shí)間。大量的研究結(jié)果顯示，孔雀石綠進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，會(huì)通過(guò)代謝作用生成脂溶性的隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)[3]?？兹甘G和隱色孔雀石綠都具有致畸、致癌和致突變等毒副作用，由于隱色孔雀石綠不易溶于水，其殘留毒性比孔雀石綠更大，它們通過(guò)食物鏈的富集和傳遞，最終會(huì)進(jìn)入到人體，嚴(yán)重威脅人類的身體健康[4-6]。目前，孔雀石綠已被美國(guó)、歐盟、日本、韓國(guó)等許多國(guó)家和地區(qū)列為禁止使用的獸藥，我國(guó)于2002年將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，要求在肉類產(chǎn)品中均不得檢出[7-8]。由于市場(chǎng)上還沒(méi)有售價(jià)低、安全可靠、藥效又好的藥品能代替孔雀石綠，所以孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用依然存在，且屢禁不止。因此，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測(cè)方法在實(shí)際檢測(cè)工作中具有重要意義。

目前檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠殘留的方法主要有膠體金免疫層析法[9]、高效液相色譜法[10-11]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]等。本研究依據(jù)GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》[14]的方法，建立了樣品經(jīng)乙腈提取和中性氧化鋁小柱凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，用UHPLC-MS/MS法測(cè)定魚(yú)肉中孔雀石綠及其代謝物殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜(1290 Infinity UHPLC，美國(guó) Agilent 公司)；三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SciexTriple Quad 4500，美國(guó)AB公司，配有電噴霧 ESI 離子源)； MS3 Digital 漩渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)；BS110S電子天平和TE212電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；Sorvall Stratos高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Milli-Q Gradient超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；Multi 9310臺(tái)式pH分析儀(德國(guó)WTW公司)；50 μL、100 μL、1 000 μL移液器(法國(guó)Gilson公司)。

甲醇、二氯甲烷、乙腈、無(wú)水乙酸等試劑均為色譜純；乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L)；乙酸銨緩沖溶液(0.1 mol/L，用乙酸調(diào)至pH=4.5)；鹽酸羥胺溶液(0.25 g/mL)；對(duì)-甲苯磺酸溶液(1.0 mol/L)；中性氧化鋁柱(1 g/3 mL)；孔雀石綠草酸鹽和隱色孔雀石綠購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，純度均大于98%；氘代孔雀石綠(MG-D5)和氘代隱色孔雀石綠(LMG-D6)購(gòu)自 WITEGA純度均大于98%。

1.2 樣品

實(shí)驗(yàn)用的6種魚(yú)類樣品為采購(gòu)于水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)的羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、鱖魚(yú)(Sinipercachuatsi)、金鯧魚(yú)(Trachinotusovatus)、烏鱧(OphiocephalusargusCantor)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取MG、LMG、MG-D5和LMG-D6標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg(精確至0.1 mg)，用少量乙腈溶解，然后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃保存。分別用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。從MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)中間液取適量配制成100.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；從MG-D5和LMG-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液取適量配制成100.0 ng/mL的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，于-18℃保存。

分別移取適量100.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和50 μL 100.0 ng/mL的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，并用乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)溶液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中內(nèi)標(biāo)含量均為5.0 ng/mL。

1.3.2 儀器條件

色譜柱為Zorbax Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；柱溫40℃；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；液相色譜流速及梯度洗脫程序見(jiàn)表1。離子源為電噴霧離子源ESI，毛細(xì)管電壓為5 500 V，離子源氣流量為25.0 mL/min，錐孔氣流量50.0 mL/min。采用正離子掃描方式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM) 。質(zhì)譜定性定量離子對(duì)信息見(jiàn)表 2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

續(xù)表1

注：流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)。

Notes：The mobile phase A was acetonitrile，while the mobile phase B was ammonium 5 mmol/L acetate aqueous solution(added 0.1% formic acid).

表2 目標(biāo)化合物液質(zhì)測(cè)定條件

注：*為定量離子。

Note：*represented the quantitation ion.

1.3.3 樣品處理

提?。悍Q取5.00 g已搗碎樣品，精確至0.01 g于50 mL離心管中，加入100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL，0.25 g/mL鹽酸羥胺溶液2 mL，1.0 mol/L對(duì)-甲苯磺酸溶液2 mL，0.1 mol/L乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)至pH=4.5)2 mL，乙腈10 mL渦旋振蕩1 min，再加入5 g酸性氧化鋁，渦旋振蕩1 min，13 000 r/min離心4 min。將上層清液轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中；殘?jiān)偌尤?0 mL乙腈振蕩2 min，13 000 r/min離心4 min，合并上清液；往上清液的離心管中加入10 mL二氯甲烷和5 mL水，渦旋振蕩2 min，13 000 r/min離心4 min。移取下層有機(jī)層至含有5 g無(wú)水硫酸鈉并用5 mL乙腈潤(rùn)洗的漏斗中，漏斗下方放置100 mL雞心瓶收集提取液，重復(fù)萃取一次，合并全部提取液于雞心瓶中，然后用5 mL乙腈將殘留在無(wú)水硫酸鈉中的目標(biāo)物沖洗至雞心瓶中。搖勻后，將雞心瓶于35℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。

將中性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化柱子。雞心瓶中的殘?jiān)? mL乙腈溶解，超聲2 min，然后將溶液移至柱子上，再用2 mL乙腈溶解雞心瓶中的殘?jiān)鼉纱?，依次過(guò)柱，收集洗脫液，35℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用1.0 mL乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)溶液定容，過(guò)0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜圖

在流動(dòng)相中加入適量低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽和甲酸，可以使目標(biāo)物在離子化過(guò)程中改善峰形、提高靈敏度和獲得更豐富的離子碎片信息。因此，本研究采用乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈和乙酸銨溶液按初始比例為30∶70 的梯度洗脫條件時(shí)，孔雀石綠、隱色孔雀石綠的分離效果好，峰形對(duì)稱尖銳，5 min完成檢測(cè)。目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC圖和MRM色譜圖如圖1所示。

注：1是氚代孔雀石綠；2是氚代隱色孔雀石綠；3是孔雀石綠；4是隱色孔雀石綠。

Notes：1(MG-D5，Rt：2.28 min)；2(LMG-D6，Rt：3.70 min)；3(MG，Rt：2.29 min)；4(LMG，Rt：3.74 min).

2.2 方法的線性范圍、檢出限

濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中內(nèi)標(biāo)含量均為5.0 ng/mL的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，MG和LMG在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。檢出限以在陰性樣品中依次添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行測(cè)定的各化合物定量離子信噪比S/N≥3定義，在0.05 μg/kg添加水平時(shí)，孔雀石綠、隱色孔雀石綠定量離子信噪比均大于3，故將其定為檢出限，其能夠滿足國(guó)標(biāo)GB/T 19857—2005的檢測(cè)要求。

表3 MG 和 LMG 的回歸方程以及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率和精密度

選用羅非魚(yú)、草魚(yú)、大菱鲆、鱖魚(yú)、金鯧魚(yú)和烏鱧作為基質(zhì)樣品，往稱取的5.00 g搗碎樣品中分別加入25、50、100 μL 100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和50 μL 100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液，按1.3.3樣品處理步驟進(jìn)行0.5、1.0、2.0 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4、表5。從表4、表5可以看出，魚(yú)肉中孔雀石綠的加標(biāo)回收率在83.6%～102.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6) 為 3.41%～6.88%；隱色孔雀石綠的加標(biāo)回收率在81.3%～103.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6) 為 3.68%～7.61%。由此可見(jiàn)，本研究所建立的實(shí)驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足檢測(cè)任務(wù)的需要。

表 4 樣品中孔雀石綠(MG)回收率和精密度(n=6)

表 5 樣品中孔雀石綠(LMG)回收率和精密度(n=6)

2.4 實(shí)際樣品測(cè)試

采用建立的檢測(cè)方法，對(duì)40份魚(yú)類樣品進(jìn)行了孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢測(cè)，均未檢出孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留。此外，運(yùn)用本方法對(duì)能力驗(yàn)證魚(yú)樣中的孔雀石綠和隱色孔雀石綠含量進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的含量分別為1.89 μg/kg和6.71 μg/kg，與實(shí)際值的偏差分別為-0.11 μg/kg和-0.29 μg/kg，獲得滿意的結(jié)果。

3 討論

3.1 提取過(guò)程的改進(jìn)

本研究將GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》方法中需用勻漿機(jī)勻漿過(guò)程優(yōu)化為采用渦旋振蕩勻漿，這樣既可以避免勻漿機(jī)勻漿后樣品殘留在刀頭上造成損失，又提高了樣品的提取速度，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

此外，GB/T 19857—2005方法中使用分液漏斗進(jìn)行液液萃取，存在分層時(shí)間長(zhǎng)、易產(chǎn)生乳化、乳化層含水量高等不利后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的情況。本研究將使用分液漏斗進(jìn)行液液萃取優(yōu)化為離心管渦旋振蕩后低溫高速離心，并用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行除水的實(shí)驗(yàn)方式，很大程度上避免了乳化情況的出現(xiàn)，也大大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。

3.2 實(shí)驗(yàn)試劑使用量的改進(jìn)

GB/T 19857—2005方法中提取過(guò)程乙腈的使用量為60 mL，二氯甲烷的使用量為50 mL，存在使用有毒試劑量較大、耗時(shí)較長(zhǎng)的情形[15]。本研究通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，乙腈的使用量為30 mL，二氯甲烷的使用量為20 mL，大大降低了有機(jī)溶劑的使用量，不但降低了實(shí)際檢測(cè)成本，減少有機(jī)廢液的產(chǎn)生量，還能縮短旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。

3.3 凈化方法的改進(jìn)

隱色孔雀石綠具有很強(qiáng)的親脂性，魚(yú)肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，脂肪含量較高，不利于孔雀石綠和隱色孔雀石綠的提取和凈化，容易在測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生離子抑制，因此有必要在前處理過(guò)程中將溶液中的脂肪去除。常用的凈化柱為酸性氧化鋁小柱、中性氧化鋁小柱、堿性氧化鋁小柱、酸性氧化鋁柱+丙磺酸PRS柱組合等[16-17]。因用乙腈活化過(guò)的酸性氧化鋁對(duì)脂肪的吸附能力弱、除脂能力弱，而堿性氧化鋁則對(duì)目標(biāo)物孔雀石綠具有一定的吸附能力，造成孔雀石綠損失。所以，本研究采用中性氧化鋁小柱進(jìn)行凈化處理，既能有效去除脂肪，又能避免對(duì)目標(biāo)化合物的吸附。

4 結(jié)論

本研究在GB/T 19857—2005方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件和色譜質(zhì)譜條件，對(duì)魚(yú)肉樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的殘留量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，孔雀石綠和隱色孔雀石綠在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。樣品加標(biāo)量在0.5、1.0、2.0 μg/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收率在81.3%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，而且優(yōu)化后的方法縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減小了實(shí)驗(yàn)試劑的使用量，提高了實(shí)驗(yàn)的效率，能夠較好地滿足實(shí)際檢測(cè)工作的需要。