錢卓真，梁 焱，王麗娟，湯水粉，羅方方，陳 思

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013； 2.海南省環(huán)境科學(xué)研究院，海南 海口 570026)

氟喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜類抗生素藥物，被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖及醫(yī)藥行業(yè)。由于該類藥物的大量及不恰當(dāng)使用，大量藥物被直接排入環(huán)境中，或通過人體、動(dòng)物以間接方式進(jìn)入環(huán)境[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氟喹諾酮類藥物不僅在動(dòng)物源性食品中廣泛被檢出，而且在環(huán)境水體[3-5]、沉積物[6-8]、土壤[9]中也普遍被檢出。該類藥物在沉積物和土壤中性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長(zhǎng)，不易降解[10-11]，可對(duì)環(huán)境造成直接污染。且該藥物還可能對(duì)土壤和沉積物中微生物的耐藥性產(chǎn)生壓力，誘導(dǎo)抗生素抗性基因和耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的生態(tài)毒性[12-13]。因而氟喹諾酮類藥物引起的環(huán)境污染問題已成為近年來國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[14]。

目前已報(bào)道的檢測(cè)方法有電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光偏振免疫分析法等。其中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，已成為氟喹諾酮類藥物殘留測(cè)定的主要檢測(cè)方法。與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合的傳統(tǒng)凈化方法主要是固相萃取法，但其步驟繁瑣、耗時(shí)，費(fèi)用較高。雖然近幾年基于固相萃取法衍生出一系列新的凈化方法，如磁性氧化石墨烯固相萃取法[15]、分子印跡固相萃取法[16]等，但整體研究難度仍偏大。2003年美國(guó)農(nóng)業(yè)部提出了一種快速、簡(jiǎn)單、成本低廉的新型分散固相萃取凈化技術(shù)。該技術(shù)問世以來，已經(jīng)成為了全球檢測(cè)水果、蔬菜中農(nóng)殘的標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法，近年來也涉及到越來越多的不同領(lǐng)域，比如肉類、血液、酒，但應(yīng)用于沉積物中氟喹諾酮類藥物殘留測(cè)定的研究鮮有報(bào)道。

本研究考察了不同吸附劑凈化效果，將優(yōu)化后的分散固相萃取法應(yīng)用于沉積物樣品的前處理，擬建立沉積物中5種典型氟喹諾酮類藥物同時(shí)被測(cè)定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，將為沉積物樣品中氟喹諾酮類藥物多殘留量痕量快速檢測(cè)和判斷沉積物中氟喹諾酮類藥物污染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)、沙拉沙星(Sarafloxacin，SAR)、氟羅沙星(Fleroxacin，F(xiàn)LE)購(gòu)自Dr.Ehrensorfer公司(純度>95%)；氘代諾氟沙星(Norfloxacin-D5，NOR-D5)、氘代環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin-D8，CIP-D8)、氘代恩諾沙星(Enrofloxacin-D5，ENR-D5)購(gòu)自Witega公司(純度>99%)。上述標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃下避光保存，有效期為6個(gè)月；用甲醇配制成NOR、CIP、ENR、SAR、FLE的1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃下避光保存，有效期為1個(gè)月；用甲醇配制成NOR-D5、CIP-D8、ENR-D5的1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃下避光保存，有效期為1個(gè)月。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tidea公司；乙酸銨、磷酸(H3PO4)、二水合磷酸二氫鉀(KH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、氯化鈉(NaCl)為化學(xué)純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂(MgSO4)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18均購(gòu)置天津博納艾杰爾科技有限公司；0.22 μm尼龍微孔濾膜購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。磷酸鹽緩沖溶液：2.72 g KH2PO4·2H2O與0.13 mL H3PO4，用超純水定容至100 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ QUANTUM ULTRA 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo-Fisher Scientific公司；AB204-E型、PL203型電子分析天平：Mettler Toledo公司；DT5-5型低速臺(tái)式離心機(jī)、GT16-3高速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；TDL-80-2B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；MS3型旋渦混合器：德國(guó)IKA公司；ZZDCH16水浴氮吹儀：廣州智真生物科技有限公司；KQ3200E超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司； Milli-Q型超純水儀：美國(guó)Millipore公司。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：Ultimate XB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：4 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸甲醇；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。電噴霧電離(ESI)正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力55 Arb，輔助氣壓力15 Arb，離子傳輸管溫度320℃，霧化室加熱溫度220℃，碰撞氣1.5 mtorr；母離子、子離子和碰撞能量見表2；Q1半峰寬為0.7 Da，Q3半峰寬為0.7 Da。

表1 梯度洗脫程序

表2 氟喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)

注：*表示定量離子。

Note：*indicated quantitative ion.

1.4 樣品前處理

稱取(2.00±0.02)g試樣于50 mL塑料離心管中，加入0.15 g Na2EDTA、20 mL乙腈-磷酸鹽(1∶1，V/V)緩沖液，NOR-D5、CIP-D8、ENR-D5內(nèi)標(biāo)各50 ng，渦旋1 min，超聲5 min，劇烈手搖2 min，再加入2 g NaCl繼續(xù)手搖1 min，4 000 r/min離心5 min；移取7～8 mL上清液于15 mL含有分散固相萃取材料(0.25g MgSO4、0.05 g C18、0.12 g PSA、0.01 g GCB)的離心管中，渦旋1 min，手搖1 min，3 000 r/min離心3 min，移取5 mL上清液，50℃氮吹至干。加入流動(dòng)相溶液(流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=7∶3，V/V)0.5 mL超聲溶解，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物具有兩性基團(tuán)，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中通常以離子形式存在，易與色譜柱內(nèi)硅膠殘留的硅醇基作用，從而造成色譜峰拖尾、峰形異常和保留值不穩(wěn)定。試驗(yàn)比較了不同品牌的色譜柱，最終選擇了端基封尾較好的Ultimate XB-C18色譜柱。同時(shí)嘗試了乙腈、甲酸、乙酸銨之間多種配比的流動(dòng)相條件，經(jīng)過多次比較優(yōu)化，本試驗(yàn)采用含4 mmol/L乙酸銨的0.1 %甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液，采用梯度洗脫程序，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氟羅沙星在10 min內(nèi)被洗脫且分離良好，峰型尖銳對(duì)稱。

用注射針吸1 μg/mL氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動(dòng)泵以5 μL/min的速度直接注入離子源，在正離子掃描方式下，分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1掃描)、二級(jí)質(zhì)譜分析(Q3掃描)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析，接著分別再對(duì)碰撞氣能量、電噴霧電壓、鞘氣壓力、輔氣壓力、離子源溫度、霧化室溫度進(jìn)行優(yōu)化，使每種藥物的分子離子與特征碎片離子(子離子)產(chǎn)生的離子對(duì)信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，從中選擇每種藥物的監(jiān)測(cè)子離子對(duì)。LC/MS/MS標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取

提取溶液仍選用常用的土壤抗生素提取溶液——磷酸鹽緩沖溶液與乙腈混合溶液。試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法[17]，主要是利用超聲波的空化、機(jī)械及熱效應(yīng)等來增強(qiáng)提取溶液分子的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，從而提高氟喹諾酮類藥物的提取效率。且考察了1、2、5、7 min超聲提取時(shí)間對(duì)氟喹諾酮類藥物的提取效果。結(jié)果表明，隨著提取液與目標(biāo)物超聲接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)物提取效率隨之增大。當(dāng)超聲時(shí)間增至5 min時(shí)，目標(biāo)物平均回收率達(dá)到67.9%～112%。而當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)至7 min時(shí)，目標(biāo)物回收率無受影響。為了保證提取效率，同時(shí)減少雜質(zhì)干擾，試驗(yàn)最終選擇5 min作為超聲提取時(shí)間。試驗(yàn)中加入NaCl，有助于提取液的乙腈層和水層分開。

2.2.2 樣品凈化

沉積物樣品中存在脂肪、色素、甾醇等雜質(zhì)，因而分散固相萃取法的關(guān)鍵是吸附劑的選擇，既能有效除去沉積物中雜質(zhì)，又不會(huì)吸附目標(biāo)物。常見的分散固相萃取法的吸附材料有MgSO4、PSA、C18、GCB等。作為傳統(tǒng)干燥劑，MgSO4用于去除有機(jī)溶劑殘留的水，且吸水放熱的過程可促進(jìn)目標(biāo)物的溶出[18]。PSA含有兩個(gè)氨基，可有效吸附糖類、色素、脂肪酸和其他極性有機(jī)酸[19-21]。C18含有十八烷基官能團(tuán)，屬于非極性吸附劑，可以吸附脂肪和一些礦物質(zhì)[22]。GCB保留特殊的層狀結(jié)構(gòu)，能夠吸附色素、甾醇等雜質(zhì)[23]。為了選擇合適的吸附劑，試驗(yàn)考察了4種吸附劑量對(duì)目標(biāo)物氟喹諾酮類藥物回收率的影響，設(shè)計(jì)了4個(gè)水平：MgSO4(1.00、0.75、0.50、0.25 g)，PSA(0.20、0.15、0.12、0.10 g)，C18(0.15、0.10、0.05、0 g)，GCB(0.04、0.02、0.01、0 g)，見圖2～圖5。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加濃度為25 μg/kg水平下，單獨(dú)采用PSA、C18凈化，凈化效果不佳；因而選用MgSO4、PSA、C18、GCB作為混合凈化吸附劑。隨著PSA用量的增加，回收率降低(圖2)；隨著C18用量的增加，回收率先升高隨后降低(圖3)；隨著MgSO4用量的增加，回收率急劇降低(圖4)；在保證回收率的基礎(chǔ)上，少量GCB的加入，可有效除去提取液中的色素(圖5)。經(jīng)優(yōu)化，綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定0.25 g MgSO4、0.12 g PSA、0.05 g C18、0.01 g GCB作為凈化吸附劑。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

在電噴霧有機(jī)質(zhì)譜電離條件下，沉積物樣品提取液具有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，這主要來源于沉積物樣品中脂肪、色素、甾醇等雜質(zhì)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量偏差[24]，試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法，移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白沉積物樣品提取液分別配制成不同質(zhì)量濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，目標(biāo)物濃度分別為2.5、5、10、50、100和200 ng/mL，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為100 ng/mL。以各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，各目標(biāo)物與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分濃度與其色譜峰面積比呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算定量限，具體數(shù)值見表3。

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

以實(shí)際采集的養(yǎng)殖區(qū)泥質(zhì)為研究對(duì)象，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，分別以低、中、高三個(gè)添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做5個(gè)平行試驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度及精密度。如表3所示，平均回收率在79.8%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.2%～9.9%。30 d內(nèi)25 μg/kg加標(biāo)濃度下進(jìn)行6次標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，考察方法日間精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.3%～8.6%(表3)。方法的精密度和準(zhǔn)確度均能滿足藥物殘留監(jiān)測(cè)需求。選取3種類型的的沉積物——泥質(zhì)、泥沙、沙質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象，25 μg/kg加標(biāo)濃度下考察方法適用性，回收率為87.1%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～9.0%(表4)。該方法適用范圍廣。

表3 方法準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定結(jié)果

表4 不同類型的沉積物樣品加標(biāo)回收率(n=5)

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)沉積物中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氟羅沙星殘留的分析方法，并對(duì)色譜條件、質(zhì)譜條件、樣品提取凈化方法進(jìn)行了優(yōu)化，方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度和各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿足國(guó)內(nèi)外殘留檢測(cè)的相關(guān)要求。且該方法實(shí)用性強(qiáng)，適用于大批量樣品的測(cè)定，可作為沉積物樣品中氟喹諾酮類藥物多殘留量痕量快速檢測(cè)的方法，并為沉積物中氟喹諾酮類藥物污染的判定提供技術(shù)支持。