郝占武，張 志，張美晶，單 虎，李曉成*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是20世紀80年代發(fā)現(xiàn)的一種無囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，分為PCV1和PCV2兩個亞型，PCV1感染后不引起任何臨床癥狀，PCV2感染后則會引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、皮炎性腎病、漸進性消瘦、呼吸道癥狀、黃疸、生長發(fā)育不良等多種癥狀[1-4]。自1998年中國首次發(fā)現(xiàn)PCV2以來，PCV2在我國豬群迅速蔓延開來，呈現(xiàn)出覆蓋面廣、感染率高的特征，已經(jīng)成為嚴重危害我國豬群的主要病原之一[5-7]。2016年，美國學者Phan T G等[8]和Palinski R等[9]報道了一種新的豬圓環(huán)病毒亞型(PCV3)，攜帶該病原的豬呈現(xiàn)生長發(fā)育不良、心臟和多系統(tǒng)炎性浸潤等病理變化，并在隨后開展的流行病學調查中證實豬群中確實存在PCV3[8-9]。2017，我國學者Shen H等[10]也從發(fā)病的豬樣品中檢測到了PCV3，證明該病原也存在于我國豬群中。對PCV3這樣一種新發(fā)現(xiàn)病原來說，建立一種快速、準確的檢測方法是當務之急，但目前相關文獻中PCV3的檢測采用二代測序的方法[8]，該方法所需費用多，大大限制了其應用，因此，急需建立一種方便、敏感和特異的檢測方法。本實驗室在前期工作中已經(jīng)建立了普通的PCR，在PCV3的流行病學調查和監(jiān)測工作中發(fā)揮了重要作用(另文報道)，但普通PCR存在敏感性不足的問題，為此，本實驗室在此基礎上，結合SYBR Green Ⅰ技術，以最近公布的NCBI上的PCV3基因組序列為參考毒株，又建立了一種基于SYBR Green Ⅰ的實時熒光定量PCR檢測方法，以期為后續(xù)的研究工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和樣品 經(jīng)PCR檢測和測序驗證為PCV3陽性的樣品，來自山東某發(fā)病豬場，用于構建陽性質粒的模板。采集23份豬樣品，分別來自福建、山東、河南等省份的豬群腹瀉樣品或健康組織，用于PCV3臨床應用檢測。PCV1、PCV2、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvo virus，PPV),中國動物衛(wèi)生流行病學中心畜病監(jiān)測室分離鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑 ExTaq、SYBR Premix ExTaq試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品； DNAzol，Life公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和合成 以NCBI上公布的我國PCV3全基因組序列(KY418606.1)為參考序列，利用DNA Star軟件設計1對上、下游引物用于進行SYBR Green Ⅰ反應，上游引物為PCV3-F110：5′-GATGATGAAGCGGCCTCGTGTTTTGA-3′；下游引物為：PCV3-R284：5′-TCGGTCGGGGTCCAGTTGTTTATCGTA-3′；可以擴增175 bp的片段，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 樣品DNA的提取 根據(jù)DNAzol說明書，從豬樣品和其他病毒液中提取總DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽性質粒的制備 以1.2.1設計的引物和中國動物衛(wèi)生流行病學中心畜病監(jiān)測室保存的PCV3陽性樣品作為模板，進行PCR擴增和制備陽性質粒。

1.2.4 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的建立

1.2.4.1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR反應體系的建立和反應條件優(yōu)化 以PCV3陽性質粒作為模板的標準品進行實時熒光定量PCR反應，使用25 μL反應體系，SYBR Premix ExTaq混合物12.5 μL，上游引物和下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 2 μL，用ddH2O 補充至25 μL。擴增條件為： 95℃預變性3 min；95℃10 s,60℃ 20 s,共40個循環(huán)；60℃讀取熒光值，熔解曲線分析條件為95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s。

1.2.4.2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR標準曲線的建立 將已知濃度的PCV3陽性質粒分別進行10倍倍比稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同的濃度作為模板進行實時熒光定量PCR擴增，將各濃度得到的Ct值為縱坐標，以稀釋倍數(shù)的對數(shù)作為橫坐標，制作標準曲線。

1.2.4.3 敏感性試驗 將提取好的樣品DNA模板用分光光度計檢測DNA的含量，然后分別10倍倍比稀釋，從109拷貝/μL稀釋到101拷貝/μL，以各稀釋度作為模板進行SYBR-Green Ⅰ熒光定量PCR分析，然后根據(jù)Ct值和線性關系系數(shù)確定最小檢測限。

1.2.4.4 特異性試驗 用已經(jīng)建立好的方法，同時擴增豬圓環(huán)病毒PCV1、PCV2、PRV、PPV等提取的DNA模板，觀察實時熒光定量PCR反應結果，評價本方法的特異性。

1.2.4.5 重復性試驗 將已知濃度的PCV3陽性質粒模板分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每個濃度分別用本方法重復檢測3次，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析，評價本方法的重復性。

1.2.5 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的應用 采用建立的SYBR Green Ⅰreal-time PCR，對臨床采集的23份豬樣品進行檢測，并將特異性條帶進行測序和分子進化樹分析，評價本方法的可行性。

2 結果

2.1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的建立

將PCV3陽性質粒的濃度調整為5×1010拷貝/μL，然后將陽性質粒10倍倍比稀釋，取濃度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀釋陽性質粒作為模板進行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR擴增，發(fā)現(xiàn)隨著模板拷貝數(shù)的降低，Ct值逐漸增加，10-2～-10-8等7個不同稀釋度對應的熒光PCR的Ct值分別為 8.43、11.42、14.34、17.87、20.64、23.18、29.61，擴增曲線仍然為一條典型的“S”形擴增曲線，同時熔解曲線也清晰地顯示該擴增曲線只有一個峰值，但當樣品的稀釋濃度為10-9時，熒光PCR則擴增不出典型的特異性曲線，這表明，樣品的10-9倍稀釋(濃度為50拷貝/μL)是本方法的檢測極限(圖1)。

A.樣品;B.熔解曲線

A.Samples;B.Melting curves

圖1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的敏感性試驗結果

Fig.1 Sensitivity test results of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR標準曲線

用上述10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同濃度的陽性質粒稀釋液作為模板進行real-time PCR擴增和制作標準曲線(圖2)，從圖2可以看出，不同濃度的樣品稀釋倍數(shù)與Ct值之間呈現(xiàn)較強的線性關系，根據(jù)熒光PCR儀自帶的軟件分析，可以得到相關的回歸方程：y=2.998 3x+2.487 7，相關系數(shù)R2=0.998 1，表明該方法穩(wěn)定性好，無論樣品濃度高還是較低，其檢測結果的誤差都非常小，與理論值非常接近。

圖2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的標準曲線

2.3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的特異性

用建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR對PCV1、PCV2、PRV、PPV等其他DNA病毒進行檢測，結果表明，這些病毒均為陰性，沒有擴增出特異性的條帶，表明本方法對PCV3具有良好的特異性，對其他類似的DNA病毒無擴增交叉反應(圖3)。

2.4 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的重復性

將PCV3陽性質粒的濃度調整為5×1010拷貝/μL，取陽性質粒DNA的10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同濃度的稀釋液進行SYBR Green Ⅰ real-time PCR擴增，重復3次后進行統(tǒng)計分析，3次重復的變異系數(shù)(CV)均小于3%，表明本方法的重復性較好(表1)。

A.樣品;B.熔解曲線

A.Samples;B.Melting curve

圖3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR特異性試驗結果

注：“-”表示陰性。

Note："-"Means negative.

2.5 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的初步應用

用建立的real-time PCR方法對23份臨床采集的豬樣品進行檢測，結果有5份樣品擴增出典型的S型曲線，熔解曲線也顯示只有一個峰，且峰值與陽性樣品的峰值一致(圖4)。選擇其中5個特異性條帶進行測序和分子進化分析，這5份樣品條帶的核酸序列與PCV3參考毒株(KY418606.1)的同源性為97.2%～99%，表明這些擴增的條帶都是PCV3特異性的，說明本方法用于實際生產(chǎn)中PCV3的流行病學調查和監(jiān)測是可行的。

A.熔解曲線;B.臨床樣品

A.Melting curve;B.Clinical samples

圖4臨床樣品SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測結果

Fig.4 Detection result of clinical samples with PCV3 by SYBR Green Ⅰ real-time PCR

3 討論

近年來，以SYBR Green Ⅰ染料法和TaqMan探針法為代表的實時熒光定量PCR發(fā)展極為迅速[11-12]。相比TaqMan探針法而言，SYBR Green Ⅰ染料法操作簡便，其原理是作為不對稱菁類熒光素的SYBR Green Ⅰ能與DNA小溝結合，而且二者一旦結合后,形成的熒光大大增強，隨著PCR的進程熒光信號不斷增加，從而形成特異性的“S”型擴增曲線，且熒光的強度與原始模板的濃度呈正相關，因此可以對靶核酸進行定量檢測。SYBR Green Ⅰ染料法避免了探針引物的設計和標記，具有應用靈活、操作簡單、敏感性高和特異性強的特點，它允許靶基因對應的引物上少量堿基發(fā)生變異而不影響擴增效果，同時結合樣品熔解曲線有無峰和峰的位置可做出準確判斷，因此在疫病病原的檢測中廣為使用。但有關PCV3的實時熒光定量PCR方法國內外均尚未見到相關報道，為此，本文基于SYBR Green Ⅰ首次建立了檢測PCV3的real-time PCR方法，且在特異性試驗、敏感性試驗、重復性試驗以及臨床應用中都顯示了較好的效果。

由于PCV3發(fā)現(xiàn)時間不長，對PCV3的核酸信息了解較少，因此，在初期采用SYBR Green Ⅰ染料法是一個比較適宜的方法，可用于PCV3感染的流行病學調查和檢測，有助于早期發(fā)現(xiàn)PCV3的感染和流行，及時采取有效措施預防和控制。我們在前期設計引物時曾經(jīng)設計了5對位置不同的引物(略)，同時用這5對引物進行了SYBR Green Ⅰ熒光PCR試驗，經(jīng)過比對后發(fā)現(xiàn)只有1對引物的特異性、敏感性和重復性較好，因此本文只列出了該對引物。盡管如此，從該試驗中也可知，不同位置的引物建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR之間在PCV3的檢測效果上存在較大差異，因此，在設計引物時一定要設計多對引物進行相關試驗，從中篩選最佳引物，建立最佳的檢測方法。

我國是世界第一養(yǎng)豬大國，每一種新的豬病發(fā)生和流行都會給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失，必須引起人們的重視。及時準確地發(fā)現(xiàn)病原是預防和控制疫病流行的基礎，相信本文建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR，一定會在PCV3的流行病學調查和監(jiān)測工作中發(fā)揮重要作用。