張 晶，王桂琴

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

氟喹諾酮類藥物屬于第3代喹諾酮類抗菌藥，它是將氟原子引入喹諾酮萘啶環(huán)的6位處，哌嗪環(huán)連在7位上，因此又被統(tǒng)稱為氟喹諾酮類[1]。氟喹諾酮類藥物是一種人工合成的抗菌藥物，通過對DNA回旋酶進(jìn)行抑制，從而導(dǎo)致染色體的不可逆損害[2]。由于質(zhì)粒傳導(dǎo)耐藥性并不會對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生影響，因此它與許多抗菌藥物之間沒有交叉耐藥性；同時因其有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、組織穿透力強(qiáng)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，而在人類及動物感染性疾病的預(yù)防和治療中被廣泛地應(yīng)用[3-5]。特別是在獸醫(yī)臨床方面，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖專用的抗菌藥物。由于在動物體內(nèi)氟喹諾酮類藥物的殘留消除緩慢，過量的藥物殘留被人體攝入后，會損害人體健康[6]。因此，對此類藥物的殘留檢測，各國都制定了相關(guān)的檢測法規(guī)。氟喹諾酮類藥物在臨床上常被用作抗菌類藥物，少量使用時，對動物的生長具有一定的促進(jìn)作用，但如果過量使用會造成藥物在動物性食品中殘留，不僅會發(fā)生過敏反應(yīng)，可能還會伴隨其他不良反應(yīng)[7]。同時使用該藥物過量時，可能還會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和肝腎等器官的病變，因此氟喹諾酮類藥物必須嚴(yán)格控制用量，以確保家禽及其產(chǎn)品安全[8-9]。

建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法，檢測動物性食品中氟喹諾酮類藥物的殘留量，以此對食品中氟喹諾酮類藥物的含量進(jìn)行監(jiān)控，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，國內(nèi)外對氟喹諾酮類藥物常用檢測技術(shù)的研究報(bào)道較多[10-13]，其中已有較多的文獻(xiàn)對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了報(bào)道[14-18]，其在食品質(zhì)量安全檢測中的作用也越來越重要。本試驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時檢測雞蛋中7種氟喹諾酮類藥物的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 環(huán)丙沙星，購自中國食品藥品研究所；洛美沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、諾氟沙星和惡喹酸，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。檸檬酸(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈溶液(體積比為40∶60)、甲酸(99%)、氫氧化鈉(分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(分析純)，科密歐試劑公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters ACQUITY UPLC/TQ-S micro)，美國Waters公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)CR22G，日本日立公司產(chǎn)品；旋渦混勻器MS3，IKA公司產(chǎn)品；電子天平AX-205、電子天平PL202-L、酸度計(jì)GB/T11165，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；振蕩器WSZ-100-A，上海安亭公司產(chǎn)品；組織勻漿機(jī)，JKA公司產(chǎn)品；氮吹儀N-EVAP112，美國Organomation Associates JnC公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉71.63 g，用水溶解后，用容量瓶定容至1 000mL；0.1 mol/L檸檬酸溶液：稱取檸檬酸21.01 g，用水溶解后，用容量瓶定容至1 000 mL；Mcllvaine緩沖溶液：把1 000 mL 0.1 mol/L的檸檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液混合，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為4.0±0.05；0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉，然后將其加入1 625 mL的Mcllvaine緩沖溶液中，振蕩搖勻，使其充分溶解；50 mL/L甲醇水溶液;2 mL/L甲酸水溶液。

1.2.2 儲備液的配制 分別將各標(biāo)準(zhǔn)品精確稱取0.010 0 g，放置于10.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇使其溶解，并定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為1 mg/mL，置-20℃冰箱中保存，3個月內(nèi)使用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 將1.2.2配制的各標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。各組分的濃度為10 μg/mL。將此標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃保存，3個月內(nèi)使用。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 提取 將均質(zhì)試樣準(zhǔn)確稱取5.00 g，置于50 mL離心管中，然后加入Mcllvaine EDTA- Na2緩沖溶液液10 mL，渦旋混勻1 min，振蕩10 min，于-4℃、10 000 r/min離心5 min后，將上清液提取轉(zhuǎn)移至另一50 mL的離心管中，在上清液中加10 mL的水飽和正己烷，渦旋混勻，振蕩10 min后，于-4℃、10 000 r/min離心5 min，將下層備用液用吸管轉(zhuǎn)移至另一50 mL的離心管中，然后再加入10 mL水飽和正己烷，渦旋混勻，振蕩10 min，于-4℃、10 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，下層備用液過柱。

1.2.4.2 凈化 用6 mL甲醇洗滌HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)，并用6 mL的水進(jìn)行活化。然后將1.2.4.1提取的備用液過柱，過柱的速度最好為2 mL/min～3 mL/min，將濾液棄去，用2 mL 50 mL/L的甲醇水溶液進(jìn)行淋洗，同樣將淋洗液棄去，并把小柱抽干，再用6 mL的甲醇進(jìn)行洗脫，并收集洗脫液，將洗脫液用氮?dú)獯蹈珊?，最后? mL 2 mL/L甲酸水溶液進(jìn)行溶解，10 000 r/min渦旋混合1 min，將溶液過膜后，用于上機(jī)測定。

1.2.5 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTMREH C18柱(100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)；柱溫為30℃；樣品室溫度為室溫；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為10μL；流動相A為乙腈，B為1 mL/L甲酸水溶液；梯度淋洗，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為正離子；毛細(xì)血管電壓為1.04 kV；源溫為150℃；脫溶劑溫度為450℃；錐孔氣流速為50 L/Hr；脫溶劑氣流速為798 L/Hr；7種氟喹諾酮類藥物定性、定量離子參數(shù)見表2；圖1為7種氟喹諾酮類藥物的定量離子流圖。

表2 7種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)譜條件及相關(guān)參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 校正曲線和線性范圍

稱取5.00 g陰性雞蛋樣品，按上述方法處理樣品，得到空白基質(zhì)液，分別加入5種氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成2.5、5、10、25、50、75、100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以所得7種氟喹諾酮類藥物的離子峰面積平均值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表3可見，5種氟喹諾酮類藥物的濃度在2.5 μg/L～100 μg/L時線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995 9。

圖1 7種氟喹諾酮類藥物定量離子流圖

2.2 檢出限和定量限

樣品的檢出限(LOD) 是以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點(diǎn)( 2.5 μg /kg) ，取信噪比S/N=3和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出；樣品的定量限(LOQ) 是以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點(diǎn)(2.5 μg/kg) ，取信噪比S/N=10和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。環(huán)丙沙星和惡喹酸的檢測限分別為1.2 μg/kg和0.05 μg/kg，定量限為24 μg/kg和1 μg/kg，其他5種氟喹諾酮類藥物的檢測限為0.5 μg/kg，定量限10 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

將陰性雞蛋樣品稱取5.00 g，進(jìn)行3個水平的回收率試驗(yàn)，濃度分別為100、200、500 μg/kg。將每個水平重復(fù)5次，每個濃度做3批，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。按照建立的方法處理樣品，測定結(jié)果見表4。7種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為36.9%～81.2%。通過測出的各組分的峰面積，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，sr) ，對該方法的精密度進(jìn)行衡量，7種氟喹諾酮類藥物的批內(nèi)精密度為2.2%～12.6%，批間精密度為1.8%～15.7%，說明該方法滿足檢測要求。

表3 7種氟喹諾酮類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物屬于酸堿兩性化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中有羧基和哌嗪基，流動相中的酸度會對化合物的峰型和響應(yīng)值產(chǎn)生一定的影響。本試驗(yàn)在流動相中加入甲酸來控制流動相的pH并提高靈敏度，試驗(yàn)中用1 mL/L甲酸水和乙腈進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 提取條件的優(yōu)化

試驗(yàn)參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21312—2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中加入40 mL EDTA-Mcllvaine提取液，超聲提取10 min，10 000 r/min離心10 min。由于雞蛋中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、脂蛋白和色素，以上操作并不能很好的去除脂肪等雜質(zhì)，因此在固相萃取時提取的上清液很容易阻塞萃取柱，導(dǎo)致試驗(yàn)無法進(jìn)行。經(jīng)過試驗(yàn)，在提取的上清液中加入水飽和正己烷去脂后，有利于固相萃取的進(jìn)行，從而提高凈化效率，縮短分析時間。經(jīng)過多次試驗(yàn)，

表4 空白添加回收率

續(xù)表4

藥物 Drug添加量/(μg·kg-1) Add amount批次Batch平均回收率/%Average recovery批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Intra-lot relative standard deviation RSD批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Inter-lot relative standard deviation培氟沙星168.36.8Pefloxacin500267.44.04.1363.23.4156.85.4100258.99.64.5362.112.6諾氟沙星145.78.4Norfloxacin200252.77.67.3351.09.2136.97.3500249.24.215.7349.13.0171.96.0100273.59.01.8374.57.9恩諾沙星162.18.6Enrofloxacin200264.75.914.9381.24.2172.012.2500266.24.27.7361.73.8175.45.05100279.32.92.5377.14.2氧氟沙星166.17.4Ofloxacin200271.95.57.0376.05.1170.36.0500268.84.42.7366.64.0157.33.8100254.110.67.1349.76.9惡喹酸147.48.5Oxolinic acid200245.12.83.4344.510.9140.94.6500248.610.010.7340.33.1

每次加入10 mL的水飽和正己烷，在進(jìn)行了2次去脂后，達(dá)到了很好的去脂效果。試驗(yàn)還比較了不同體積的提取液對回收率的影響，分別加入5 mL、8 mL和10EDTA-Mcllvaine緩沖溶液后進(jìn)行重復(fù)提取1次，結(jié)果圖2所示，除惡喹酸外其他藥物加入10 mL提取液的回收率比較高。同時對加入10 mL提取液提取1次和提取2次進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，加入10 mL提取液提取1次的回收率較高。因此，確定本試驗(yàn)的提取方法為加入10 mL EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取1次。

圖2 提取液體積對7種氟喹諾酮類藥物回收率的影響

圖3 提取次數(shù)對7種氟喹諾酮類藥物回收率的影響

3.3 純化條件的優(yōu)化

雞蛋中油脂含量較高，如果處理不干凈，會影響方法的準(zhǔn)確度和結(jié)果的穩(wěn)定性。EDTA-Mcllvaine緩沖溶液中含有許多共萃取物，以脂肪為主，采用高速冷凍離心輔以正己烷脫脂的除脂法，可以有效地去除樣品中的脂肪類干擾物。在低溫狀態(tài)下，脂肪粒以固體狀態(tài)從溶液中析出，未分離的油脂則被正己烷除去，以達(dá)到純化分離的目的。本方法建立中比較了4℃離心和冷凍離心(-4℃)對7種氟喹諾酮類藥物回收率的影響，結(jié)果在冷凍離心條件下，藥物的回收率較高。因此，本方法建立中選擇高速冷凍離心輔以正己烷脫脂的除脂法。

3.4 樣品的檢測

按照上述建立的方法，分別對2017年寧夏地區(qū)抽取的51份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，此次抽取的樣品中均未檢出含有7種氟喹諾酮類藥物殘留。

本次建立了一種用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的方法，能滿足雞蛋中7種氟喹諾酮類藥物檢測的要求。本次建立的方法在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21312—2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的基礎(chǔ)上，對樣品前處理的過程進(jìn)行了優(yōu)化，使樣品的處理快捷便利，靈敏度高，選擇性好，且能高效、快速地檢測多種抗生素，可有效應(yīng)用于雞蛋品質(zhì)的監(jiān)控。