賀繼剛，李貝貝，韓金秀，李洪榮，撒亞蓮，嚴(yán)丹，楊曉華*

冠心病引起的心肌梗死（即心肌損傷）已成為目前世界范圍內(nèi)的頭號(hào)“殺手”。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)：2000—2012年冠心病位居世界人口死亡原因首位［1-2］。目前冠心病的治療主要包括外科治療、內(nèi)科治療及細(xì)胞治療。細(xì)胞治療中應(yīng)用最為成熟的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），雖然已有大量文獻(xiàn)證實(shí)BMSCs可以改善心肌梗死患者心功能［3］。但亦有學(xué)者提出，BMSCs臨床應(yīng)用尚不成熟，主要表現(xiàn)為：（1）BMSCs安全性仍不確切；（2）目前為止國(guó)際、國(guó)內(nèi)尚無文獻(xiàn)報(bào)道BMSCs能夠有效分化成為心肌細(xì)胞；（3）異體BMSCs治療心肌梗死依然遙遠(yuǎn)。前期研究證實(shí)過表達(dá)GATA-4 BMSCs可以更為有效地增強(qiáng)BMSCs的抗凋亡能力從而修復(fù)受損心?。?］。在前期研究基礎(chǔ)上［4］，本研究進(jìn)一步聚焦于細(xì)胞分泌外泌體（Exosome），其具有多種生物學(xué)功能，可以使細(xì)胞在不需要直接接觸下完成細(xì)胞間生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究提取慢病毒攜帶GATA-4轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs分泌的Exosome，通過采用體外流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting法檢測(cè)Exosome對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用；給予心肌梗死模型小鼠干預(yù)措施后提高其心功能并行心肌梗死局部脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Tunnel）檢驗(yàn)，表明過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可以通過增強(qiáng)BMSCs抗凋亡能力，有效改善心肌梗死后小鼠的心功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）本課題根據(jù)國(guó)內(nèi)外關(guān)于GATA-4、外泌體（Exosome）及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）修復(fù)心肌梗死后損傷心肌結(jié)果的提示，結(jié)合本課題組的前期研究結(jié)果提出科學(xué)問題及假說。（2）近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究側(cè)重點(diǎn)為BMSCs修復(fù)心肌梗死后損傷心肌的作用及細(xì)胞中的GATA-4獨(dú)立發(fā)生的作用，而關(guān)于BMSCs、GATA-4及Exosome與心肌損傷修復(fù)的研究鮮有報(bào)道。本研究首次明確過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome在改善心功能中起重要作用。（3）本研究從細(xì)胞系、原代細(xì)胞、組織和動(dòng)物整體水平等多方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，挖掘Exosome、GATA-4及BMSCs三者間的關(guān)系，探索Exosome修復(fù)心肌損傷可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2017年1—12月選取健康4周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠45只，均為雄性，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（川）2015—030。小鼠的喂養(yǎng)、觀察均按照非臨床研究管理規(guī)范（GLP）規(guī)定執(zhí)行［4］。30只小鼠用于體外提取細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，12只用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建心肌梗死模型，其余3只不做任何處理。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs培養(yǎng)基（低糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清）購(gòu)自美國(guó)Cyagen Biosciences公 司。Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor?488 & PI- for Flow Cytometry 購(gòu) 自 美 國(guó)Invitrogen 公司。CASPASE3、CASPASE9、CASPASE8、Cytochrome C購(gòu)自美國(guó)CST公司。Tunnel試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。CD29、CD44、CD11b、干細(xì)胞抗原1（SCA-1）抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司。CD11b Micro Beads購(gòu)自美國(guó)Miltenyi公司。ExoQuick-TC、Exosome Antibodies、Array & ELISA Kits均購(gòu)自美國(guó)SBI公司。小鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自賽齊（上海）生物工程有限公司。PHILIPS EPIQ 7C心臟超聲儀購(gòu)自美國(guó)PHILIPS公司。

1.3 小鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定 采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠BMSCs，胰酶消化傳代至第3代時(shí)采用CD11b的磁珠負(fù)選，去除造血干祖細(xì)胞。取生長(zhǎng)第8代BMSCs，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29、CD11b、CD44、SCA-1（PE-CD29 單抗 5 μl以 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b 單抗 5 μl以 1∶40 稀釋至 100 μl、PE/Cy5-CD44 5μl以 1∶20稀 釋 至 100 μl、FITC anti-mouse SCA-1 5 μl以 1∶20 稀釋至 100 μl）。

1.4 GATA-4表達(dá)豐度的檢測(cè) 采用慢病毒載體及基因開啟技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)GATA-4 BMSCs，將GATA-4基因插入慢病毒包裝質(zhì)粒GV308中，構(gòu)建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒。然后將GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑強(qiáng)力霉素（DOX）。轉(zhuǎn)染成功后采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h GATA-4表達(dá)豐度。

1.5 Exosome提取及檢測(cè) 按照ExoQuick-TC說明書提取Exosome，利用Exosome Antibodies、Array & ELISA Kits試劑盒檢測(cè)Exosome中CD9表達(dá)量并計(jì)算純度，繪制OD450處吸光度相關(guān)-回歸曲線并建立回歸方程，采用電鏡觀察Exosome形態(tài)。

1.6 體外實(shí)驗(yàn) 分組情況：與過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為A組（體外），與空載體BMSCs分泌的Exosome共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為B組（體外），與BMSCs分泌的Exosome共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為C組（體外），低氧（1%）無血清條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為D組（體外），正常條件下單獨(dú)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為E組（體外）。各組均培養(yǎng)48 h，后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率（按Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor?488 & PI-for Flow Cytometry說明書完成流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）。采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細(xì)胞色素C表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.7.1 小鼠心肌梗死模型的制備 選取30只小鼠建立心肌梗死模型。直視下氣管插管并與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接，由第3肋間進(jìn)入小鼠胸腔，以肺動(dòng)脈圓錐與左心耳右緣之間交點(diǎn)和心尖的假想連線作為小鼠冠狀動(dòng)脈前降支走行標(biāo)志，以9-0縫線于左心耳根部下方進(jìn)行縫扎，縫扎方向和左心耳下緣平行。結(jié)扎成功標(biāo)志為左心室前壁及心尖周圍心肌組織運(yùn)動(dòng)減弱，心電圖出現(xiàn)明顯的S-T段抬高、aVF導(dǎo)聯(lián)見S-T段抬高超過0.2 mV。最后縫合肋骨，關(guān)閉肋間隙。

1.7.2 檢測(cè)過表達(dá)GATA-4小鼠BMSC分泌的Exosome通過抗凋亡作用修復(fù)心肌損傷的效果 采用ExoQuick TC法提取過表達(dá)GATA-4 BMSCs、空載體BMSCs、BMSCs分泌的Exosome。小鼠心肌梗死模型建模后48 h注射80 000 μg的Exosome，分組情況（每組3只小鼠）：A組（體內(nèi)）注射過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome；B組（體內(nèi)）注射空載體BMSCs分泌的Exosome；C組（體內(nèi)）注射BMSCs分泌的Exosome；另取3只心肌梗死未處理小鼠作為D組（體內(nèi)）、3只正常小鼠作為E組（體內(nèi)）。于注射Exosome后48 h采用心臟超聲儀評(píng)估各組小鼠心功能。完成心臟彩超后采用原位免疫組化法評(píng)估心肌梗死小鼠心臟凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs鑒定結(jié)果 超過90%的小鼠BMSCs表達(dá)CD29（表達(dá)率為98.0%）、CD44（表達(dá)率為100.0%）和SCA-1（表達(dá)率為99.5%），但很少細(xì)胞表達(dá)CD11b（表達(dá)率為0.1%）。

2.2 GATA-4表達(dá)豐度 過表達(dá)GATA-4 BMSCs的GATA-4表達(dá)豐度為未過表達(dá)GATA-4 BMSCs的97.269倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 BMSCs分泌的Exosome提取及檢測(cè)結(jié)果 繪制OD450處吸光度相關(guān)-回歸曲線（見圖1）?；貧w方程y=0.014 3x+0.197 4，小鼠BMSCs分泌的Exosome 表達(dá)量為0.272 5，Exosome純度為5.25×108個(gè)。Exosome大小40～100 nm，顆粒成團(tuán)聚集（見圖2）。

2.4 體外實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞凋亡率 體外實(shí)驗(yàn)5組心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組（體外）細(xì)胞凋亡率低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外），高于E組（體外），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 體外實(shí)驗(yàn)5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較 體外實(shí)驗(yàn)5組Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；體外實(shí)驗(yàn)5組Caspase-8、細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組（體外）Caspase 8、細(xì)胞色素C表達(dá)水平低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外）及E組（體外），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2、圖3）。

2.6 小鼠心肌梗死模型心電圖 小鼠心肌梗死模型心電圖示aVF導(dǎo)聯(lián)S-T段明顯抬高，幅度＞0.2 mV，提示心肌梗死模型建立成功。開胸后結(jié)扎前，記錄aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖；結(jié)扎后再次記錄aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖可見aVF導(dǎo)聯(lián)S-T明顯抬高，幅度超過0.2 mV（見圖4）。

圖1 相關(guān)-回歸曲線Figure 1 Correlation regression curve

圖2 Exosome形態(tài)Figure 2 Exosome form

表1 體外實(shí)驗(yàn)5組心肌細(xì)胞凋亡率比較（n=3，x±s，%）Table 1 Proportion of apoptotic cells in myocardial infarction focus after intervention and adoption for 48 h among 5 groups in vitro

2.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠心功能比較 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠射血分?jǐn)?shù)（EF）、環(huán)比收縮（FS）前后差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5組小鼠環(huán)比舒張直徑（LVIDd）、環(huán)比收縮直徑（LVIDs）前后差值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A組（體內(nèi)）小鼠EF、FS前后差值高于B組（體內(nèi)）、C組（體內(nèi)）、D組（體內(nèi)）及E組（體內(nèi)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.8 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量比較 鏡下可見A組（體內(nèi)）的褐色凋亡細(xì)胞較B組（體內(nèi)）及C組（體內(nèi)）少，但較E組（體內(nèi)）多（見圖5）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組（體內(nèi)）小鼠心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量高于E組（體內(nèi)），而低于B組（體內(nèi)）、C組（體內(nèi)）、D組（體內(nèi)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

表2 體外實(shí)驗(yàn)5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較（n=3,±s）Table 2 Comparison of expression levels of caspase-3，caspase-8，caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

表2 體外實(shí)驗(yàn)5組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細(xì)胞色素C表達(dá)水平比較（n=3,±s）Table 2 Comparison of expression levels of caspase-3，caspase-8，caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

注：與A組（體外）比較，aP＜0.05

組別 Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 細(xì)胞色素C A組（體外） 1.03±0.21 0.37±0.13 1.18±0.08 0.41±0.21 B組（體外） 1.16±0.25 0.73±0.09a 1.19±0.02 0.73±0.06a C組（體外） 1.11±0.19 0.97±0.11a 1.19±0.07 0.75±0.17a D組（體外） 1.14±0.21 0.90±0.08a 1.08±0.13 0.71±0.10a E組（體外） 1.25±0.23 0.77±0.06a 1.06±0.19 0.80±0.06a F值 0.717 3.743 0.927 5.524 P值 0.805 ＜0.001 0.446 0.034

圖3 體外實(shí)驗(yàn)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、細(xì)胞色素C表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，and cytochrome C among 5 groups in vitro

表3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠心功能比較（n=3,x±s）Table 3 Comparison of the cardiac functions among 5 groups of mice in vivo

3 討論

圖4 小鼠心肌梗死模型建模前后aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖Figure 4 aVF lead electrocardiogram before and after the establishment of mouse myocardial infarction model

治療冠心病引起的心肌梗死占用了大量醫(yī)療資源。目前BMSCs治療冠心病引起的心肌細(xì)胞損傷成為研究熱點(diǎn)。但多年來BMSCs發(fā)展卻相對(duì)滯后，主要原因是BMSCs的臨床應(yīng)用安全性一直存在爭(zhēng)議。前期研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GATA-4 BMSCs可以通過增強(qiáng)干細(xì)胞的抗凋亡能力改善心肌梗死后的心功能［4］。GATA結(jié)合蛋白是具有Ⅳ型鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。有證據(jù)表明GATA-4在心肌肥大期間抑制成體心肌細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用［4］，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)GATA-4表達(dá)下降［5］。表明細(xì)胞的凋亡可以通過恢復(fù)GATA-4的作用而被減弱，GATA-4可以調(diào)節(jié)成體心臟細(xì)胞的存活。

本研究正是在前期研究基礎(chǔ)上［4］，將目光聚焦于BMSCs分泌的Exosome。Exosome是小的膜性囊泡，從20世紀(jì)90年代起受到極大關(guān)注［6-8］。此詞于1981年首先提出，是指從細(xì)胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性［7］。Exosome可能扮演細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號(hào)作用，其可以遠(yuǎn)距離運(yùn)輸并將所攜帶物質(zhì)釋放入細(xì)胞影響受體細(xì)胞的處理過程。如RNA從一個(gè)細(xì)胞穿梭到另一個(gè)細(xì)胞，被稱為“exosomal載體RNA”，能夠影響受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)生［9-10］。

表4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量比較（n=3，x± s，個(gè)/高倍鏡）Table 4 Comparison of the number of cardiomyocytes apoptosis in 5 groups of mice in vivo

圖 5 心肌梗死局部凋亡細(xì)胞（原位免疫組化法，×40）Figure 5 Apoptotic cells in myocardial infarction focus after intervention and adoption for 48 h in 5 groups

本研究提出通過提取過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome是否也可以通過增強(qiáng)干細(xì)胞抗凋亡能力進(jìn)而改善心肌梗死后小鼠的心功能。

目前認(rèn)為影響細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條：（1）通過以 Caspase-8 活化為代表的死亡受體通路，如Fas通路。（2）細(xì)胞色素C釋放及Caspase-9活化為代表的線粒體信號(hào)通路［11-12］。如果過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome具有增強(qiáng)抗凋亡能力，其是通過哪條途徑改善了細(xì)胞的凋亡情況，目前尚不清楚。而據(jù)DENG等［13］報(bào)道過表達(dá)GATA-4 BMSCs可以顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率，改善心肌梗死后心功能。本研究首次對(duì)其是否通過Exosome完成上述功能進(jìn)行了證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示：A組（體外）Caspase 8、細(xì)胞色素C表達(dá)水平低于B組（體外）、C組（體外）、D組（體外）及E組（體外）；A組（體內(nèi)）小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量高于E組（體內(nèi)），而低于B組（體內(nèi)）、C組（體內(nèi)）、D組（體內(nèi)）。初步證明過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可能是通過抑制細(xì)胞色素C釋放為代表的線粒體信號(hào)通路和Fas通路改善細(xì)胞凋亡情況。

本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步證實(shí)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在小鼠心肌梗死模型造模48 h后，經(jīng)尾靜脈注射過表達(dá)GATA-4-BMSCs分泌的Exosome、空載體-BMSCs分泌的Exosome、BMSCs分泌的Exosome，將不給予任何處理的心肌梗死模型小鼠及正常喂養(yǎng)的小鼠作為對(duì)照組。檢測(cè)給予干預(yù)措施48 h后的心功能改善情況，結(jié)果顯示：A組（體內(nèi)）小鼠EF、FS前后差值高于B組（體內(nèi)）、C組（體內(nèi)）、D組（體內(nèi)）及E組（體內(nèi)）；A組（體內(nèi)）小鼠心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量高于E組（體內(nèi)），而低于B組（體內(nèi)）、C組（體內(nèi)）、D組（體內(nèi)）。

綜上所述，過表達(dá)GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可以通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗凋亡能力，有效改善心肌梗死后小鼠的心功能。

作者貢獻(xiàn)：賀繼剛、楊曉華進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；賀繼剛、李貝貝、韓金秀進(jìn)行文章的可行性分析；李洪榮進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集、整理；賀繼剛、楊曉華撰寫論文；撒亞蓮、嚴(yán)丹進(jìn)行論文的修訂，英文的修訂；賀繼剛負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；賀繼剛、楊曉華對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。