顏雯 鐘文清 許曉雙 胡桂芳 楊美蘭 程佳

動脈粥樣硬化是多因素共同參與的血管壁的慢性炎癥性疾病, 亦是腦卒中、冠心病、周圍血管疾病的病理生理基礎(chǔ),可對人類健康造成嚴(yán)重危害［1］。動脈粥樣硬化的病理顯示,氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)識別、吞噬以及泡沫細胞形成中單核-巨噬細胞的關(guān)鍵性和特征性尤為突出, 并對動脈粥樣硬化發(fā)揮著重要作用［2］。MV是多種細胞分泌產(chǎn)生的膜囊泡, 表面蛋白具有抗原性, 易被多種受體細胞識別, 因其能轉(zhuǎn)移來源細胞相關(guān)的DNA、蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA的能力而被認為是細胞間通訊、信息傳遞的有效載體［3］。研究表明［4］, MV與動脈粥樣硬化的關(guān)系密切, 其攜帶的miRNA可對靶細胞mRNA表達進行調(diào)控, 其中miRNA-199a-3p與單核細胞的炎癥反應(yīng)相關(guān)。本次研究通過對下肢動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p的檢測, 并探討其對外周血單核細胞的影響, 具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年6月在本院就診的下肢動脈粥樣硬化閉塞癥患者(實驗組)和健康體檢者(對照組), 各60例, 取外周血標(biāo)本。實驗組患者的入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前影像學(xué)檢查［下肢血管彩超或CT血管成像(CTA)］確診下肢動脈有動脈粥樣硬化斑塊并血管狹窄的患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝腎功能不全者、惡性腫瘤及孕婦患者。實驗組男36例, 女24例；年齡40～78歲, 平均年齡(66.9±5.2)歲。對照組男34例, 女 26例；年齡40～80歲, 平均年齡(67.2±4.8)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。新鮮血管組織標(biāo)本取自1例在本院就診的下肢動脈粥樣硬化閉塞癥患者的截肢遠端血管, 以其截肢近端血管作為對照。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-199a-3p表達水平檢測 ①血管組織：取新鮮血管組織標(biāo)本, 分別提取總RNA, 按照試劑盒說明書采用莖環(huán)引物的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-199a-3p水平。②MV：磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶7的比例加入外周血中進行稀釋, 100000 r/min離心, 2 h, 棄上清液, 沉淀為抽提的MV, PBS懸浮, -80℃保存, 以上述同樣方法進行miR-199a-3p檢測。③外周血單核細胞：6%右旋糖酐溶液加入新鮮外周血, 靜置60 min, 上層液置入其他試管 , 加 入 Hank’s液 (無 Mg2+、Ca2+), 混勻 , 2000 r/min 離心, 10 min, 棄上清液, 洗滌2次；以CD68為單核細胞標(biāo)志物, 分選并留取單核細胞, 以同樣方法檢測miR-199a-3p表達水平。

1.2.2 單核細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇取自液氮罐中的人單核細胞T THP-1凍存管, 采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸, 并在細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng), 5% CO2、溫度37℃,離心后傳代或換液, 維持細胞“單個、亮、圓”的懸浮狀態(tài)。細胞對數(shù)生長期, 分設(shè)miRNA-199a-3p inhibitor組、miRNA-199a-3p mimics組、空白對照組, 各組設(shè)復(fù)孔6個,轉(zhuǎn)染 miRNA-199a-3p inhibitor、miRNA-199a-3p mimics、FuGENE, 靜置15 min, 置入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng), 5% CO2、37℃, 3 d后提取RNA濃度及質(zhì)量。采用超微量分光光度儀對提取的RNA 濃度及質(zhì)量進行檢測, miR-199a-3p表達水平經(jīng)實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3 趨化因子檢測 各組單核細胞提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 采用PCR檢測MCP-1、RANTES、Fractalkine。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-199a-3p表達水平

2.1.1 血管組織內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平 動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

2.1.2 外周血單核細胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平實驗組外周血單核細胞、MV中的miRNA-199a-3p表達水平高于對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表1。

2.1.3 外周血單核細胞各組miRNA-199a-3p 表達水平miRNA-199a-3p inhibitor組外周血單核細胞中的miRNA-199a-3p表達水平低于空白對照組, miRNA-199a-3p mimics組外周血單核細胞中的miRNA-199a-3p表達水平高于空白對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表2。

2.2 單核細胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平 檢測Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平, miRNA-199a-3p inhibitor組高于空白對照組, miRNA-199a-3p mimics組低于空白對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見圖 1。

表1 實驗組和對照組外周血單核細胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平比較

表1 實驗組和對照組外周血單核細胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平比較

注：與對照組比較, ap＜0.05

組別 例數(shù) 單核細胞 MV實驗組 60 0.89±0.11a 6.29±1.22a對照組 60 0.34±0.09 3.06±0.60

表2 外周血單核細胞各組 miRNA-199a-3p 表達水平比較( x-±s)

圖1 外周血單核細胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平

3 討論

動脈粥樣硬化是個多細胞多因子參加的血管慢性炎癥過程, 其中單核巨噬細胞的誘導(dǎo)活化后粘附于血管內(nèi)皮并遷徙至內(nèi)膜下而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎? 進而釋放大量的促炎因子加重局部的炎癥反應(yīng), 是動脈粥樣硬化的病變發(fā)展的第一步。miRNA-199a-3p在19號染色體p13.2的DNM2基因16號內(nèi)含子內(nèi), 主要在胃癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤細胞中高表達,而近期有研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可抑制上述炎癥反應(yīng), 并減少泡沫細胞的形成, 而且發(fā)現(xiàn)部分預(yù)后良好的動脈粥樣硬化患者血漿中含miRNA-199a-3p的外泌體濃度偏高, 在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中miRNA-199a-3p有著重要影響［5,6］。本研究結(jié)果顯示, 動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。實驗組外周血單核細胞、MV中的miRNA-199a-3p表達水平高于對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。進一步證實動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細胞表達的miRNA-199a-3p可通過MV形式分泌入外周血, 被單核細胞吞噬并產(chǎn)生影響。此外, 由于趨化因子RANTES、Fractalkine、MCP-1與泡沫細胞轉(zhuǎn)化和動脈粥樣硬化斑塊形成密切相關(guān)［7,8］, Fractalkine是CX3C家族趨化因子, 與受體CX3CR1結(jié)合, 在動脈粥樣硬化中具促炎作用；MCP-1對平滑肌細胞增殖具有趨化和促進作用；RANTES與CCR5結(jié)合作用于T細胞、嗜酸粒細胞及單核細胞上, 可促進動脈粥樣硬化斑塊形成［9,10］。本研究發(fā)現(xiàn), 外周血單核細胞經(jīng)miRNA-199a-3p inhibitor和miRNA-199a-3p mimics成功轉(zhuǎn)染后, miRNA-199a-3p表達水平分別上調(diào)、抑制, 同時, miRNA-199a-3p對外周血單核細胞內(nèi)的Fractalkine、RANTES、MCP-1表達具有抑制作用。因此, 推測miRNA-199a-3p能夠抑制上述動脈粥樣硬化過程。

總之, 下肢動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p水平高表達, 其以MV形式分泌至外周血中, 對單核細胞中的趨化因子表達具有抑制作用, 是動脈粥樣硬化的保護因素。