徐 青 付子毅 馬慧媛 陳 艷 吳曉麗 徐 娟

南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(210004)

子宮肌瘤在40～50歲女性群體中發(fā)病率超過(guò)60%，近年來(lái)更呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]，已成為育齡期婦女行子宮切除術(shù)的首要病因[2]。其發(fā)生與細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的失衡有關(guān)，而許多藥物是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡起治療作用。近年來(lái)，隨著對(duì)子宮肌瘤病因?qū)W研究的進(jìn)展，局部應(yīng)用孕激素類(lèi)藥物的治療方法備受關(guān)注。左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)(LNG-IUS)是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)性能優(yōu)良的宮內(nèi)避孕系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，使用LNG-IUS能使子宮肌瘤變小，經(jīng)量減少，其對(duì)子宮肌瘤的治療作用可能與抑制內(nèi)膜生長(zhǎng)有關(guān)。然而LNG-IUS所形成的局部高效孕激素環(huán)境，是否還存在其他治療作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚不清楚。本院對(duì)子宮肌瘤伴月經(jīng)量多而不愿切除子宮的患者放置LNG-IUS治療，對(duì)緩解月經(jīng)過(guò)多取得了較好療效，總結(jié)分析如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

選擇2011年6月—2012年6月在南京婦產(chǎn)醫(yī)院門(mén)診就診，主訴為月經(jīng)過(guò)多，伴不同程度的貧血且不愿手術(shù)切除子宮的子宮肌瘤患者36例，年齡(38.7±7.5)歲(26.0～48.0歲)，子宮增大<12周妊娠，子宮肌瘤結(jié)節(jié)≥1個(gè)，最大直徑2.5～5.0 cm。術(shù)前簽署知情同意書(shū)，無(wú)放置LNG-IUS禁忌證，無(wú)生育要求，無(wú)反復(fù)脫器史，3個(gè)月內(nèi)未使用任何激素。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 人子宮平滑肌瘤細(xì)胞獲取(UtLMC)

術(shù)中獲取子宮肌瘤組織，采用消化法及組織塊貼壁兩種方法[3]分離培養(yǎng)肌瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)均選用第6代以?xún)?nèi)的瘤細(xì)胞。

1.3 試劑

高糖DMEM、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶、L-谷氨酰胺(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶、LNG、PI(美國(guó)Sigma公司)；二甲基亞砜、四甲基偶氮唑鹽(美國(guó)Amresco公司)；活細(xì)胞/凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞鑒別試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.4 置器方法

1.4.1 LNG-IUS放置放置前測(cè)血常規(guī)，B超測(cè)量肌瘤體積及子宮容積。于月經(jīng)后3～5 d刮除大部分內(nèi)膜后放置LNG-IUS(德國(guó)Bayer公司生產(chǎn))， B超檢查放置位置，取子宮內(nèi)膜行病理檢查。

1.4.2隨訪及觀察指標(biāo)放置LNG-IUS后第1，3，12，48個(gè)月隨訪：①月經(jīng)量變化，統(tǒng)計(jì)月經(jīng)量并按PBAC法[4]進(jìn)行評(píng)分；②貧血改善情況，觀察置器后的血紅蛋白水平的變化；③子宮瘤體及容積變化，B超測(cè)量肌瘤體積，多發(fā)性肌瘤僅測(cè)量最大肌瘤體積，B超測(cè)量子宮容積；④置器后脫落率及不良反應(yīng)的發(fā)生率，包括點(diǎn)滴出血、月經(jīng)稀發(fā)(閉經(jīng))、腰腹疼痛、分泌物增加、激素反應(yīng)等。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.5.1四甲基偶氮唑鹽法(MTT) 實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組(培養(yǎng)基添加二甲基亞楓)；加入左炔諾孕酮(LNG)組，LNG終濃度分別為5，10，15，20，25 μg/ml；加入17 -βE2組，E2終濃度分別為366，3660，36 600 pmol/L。MTT法：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UtLMC，調(diào)整細(xì)胞濃度至0.5×105/ml接種96孔板，每孔200.0μl；實(shí)驗(yàn)按對(duì)照組和LNG、E2藥物濃度梯度組，每組3復(fù)孔；在培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入5.0 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除原有培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μl，振蕩溶解紫色甲瓚，波長(zhǎng)570 nm在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算LNG、E2各濃度在不同時(shí)間段對(duì)UtLMC的增殖抑制指數(shù)(IR)。IR=[(對(duì)照組A值-加藥組A值)/對(duì)照組A值]×100%。

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UtLMC，按0.5×105/ml細(xì)胞濃度接種于50.0ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度>60.0%，更換含LNG的無(wú)血清培養(yǎng)液，藥物濃度分別為0，10，15，20，25 μg/ml，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 計(jì)量資料以均數(shù)示，統(tǒng)計(jì)處理采用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LNG、E2對(duì)UtLMC的增殖調(diào)節(jié)作用

MTT結(jié)果表明：①與對(duì)照組相比，較低濃度LNG(<10 μg/ml)增強(qiáng)UtLMCs的細(xì)胞活力，當(dāng)LNG濃度達(dá)10.0μg/ml后，對(duì)UtLMCs出現(xiàn)抑制作用，并隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)及藥物濃度的增加抑制作用加強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間及藥物濃度依賴(lài)性(表1)。②與對(duì)照組相比，48 h內(nèi)，低濃度E2(≤366 pmol/L)抑制UtLMCs的細(xì)胞活力，高濃度E2(≥3660 pmol/L)增強(qiáng)UtLMC的增殖活力；但隨著E2暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，72 h時(shí)≤3660 pmol/L E2抑制UtLMCs的增殖能力，而高濃度E2(≥36 600 pmol/L)顯著增強(qiáng)UtLMC的增殖能力(圖1)。

表1 不同濃度LNG在各作用時(shí)間時(shí)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制作用比較

*與對(duì)照組比較P<0.05

圖1 E2對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞的增殖活力影響(MTT法)

2.2 LNG對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，在不同濃度的LNG處理作用下(0，5，10，15，20，25 μg/ml)，細(xì)胞凋亡率分別為2.9%，3.8%，9.2%，13.7%，18.8%，23.4%。提示，自LNG 10.0 μg/ml濃度開(kāi)始，與對(duì)照組相比UtLMCs的凋亡率出現(xiàn)差異，且UtLMCs的凋亡率隨LNG濃度增加而逐漸升高，具有濃度梯度依賴(lài)性(r2=0.9799，P=0.036)(圖2)。

2.3 臨床指標(biāo)變化

置器1個(gè)月后婦女月經(jīng)量較放置前明顯減少，血紅蛋白水平顯著提高，子宮容積較放置前縮小(P=0.028)；隨置器時(shí)間延長(zhǎng)臨床效果更為明顯；放置后子宮肌瘤的大小有縮小的趨勢(shì)但與放置前比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.078)。 見(jiàn)表2。

表2 置器前后臨床情況比較

*與置器前比較P<0.05

LNG 濃度(A: 對(duì)照組; B: 5μg/ml; C: 10 μg/ml; D: 15 μg/ml; E: 20 μg/ml; F: 25 μg/ml)圖2 不同濃度LNG作用后UtLMCs的流式分析圖

2.4 副作用情況

放置1個(gè)月后隨訪，1例LNG-IUS脫落，不規(guī)則陰道點(diǎn)滴出血副作用發(fā)生率最高，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，大部分至3～6個(gè)月消失。所有痛經(jīng)患者放置LNG-IUS 3個(gè)月痛經(jīng)全部消失；9例在放置后10個(gè)月閉經(jīng),5例在放置1年后閉經(jīng)；1例放置后9個(gè)月行子宮肌瘤剔除術(shù)，術(shù)后繼續(xù)放置LNG-IUS，未出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象。見(jiàn)表3。

表3 放置LNG-IUS后不同時(shí)期副作用發(fā)生情況[例(%)]

3 討論

子宮肌瘤是由子宮的平滑肌細(xì)胞演變而來(lái)，由單一的肌瘤細(xì)胞分裂增殖而成的一種單克隆良性腫瘤[4]。各國(guó)學(xué)者一直致力于該病病因及其發(fā)病機(jī)制的研究，目前認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展可能與遺傳、卵巢內(nèi)分泌功能、雌(孕)激素及肌瘤組織中雌(孕)激素受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞凋亡、癌基因與抑癌基因、細(xì)胞免疫、表觀遺傳學(xué)等因素有關(guān)[5-7]。

子宮平滑肌瘤為卵巢性激素依賴(lài)性腫瘤，雌(孕)激素的濃度被認(rèn)為是其生長(zhǎng)的主要決定因素。Brandon等[8]已經(jīng)揭示了相比于正常的子宮肌層，子宮平滑肌瘤中的雌、孕激素受體的表達(dá)有所增加。2015年SOGC子宮肌瘤管理指南中表明天然或合成的孕激素對(duì)子宮肌瘤生長(zhǎng)可能有雙重調(diào)節(jié)作用[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用LNG-IUS對(duì)于子宮平滑肌瘤的治療有效，會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜萎縮性的變化，使其增殖減少和凋亡增加，每月的月經(jīng)出血量有明顯下降[10-11]。Grigorieva等[12]將LNG-IUS用于子宮平滑肌瘤合并月經(jīng)過(guò)多的前瞻性自身對(duì)照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LNG-IUS能使肌瘤變小。這些均提示孕激素可能對(duì)子宮肌瘤的生長(zhǎng)具有雙重調(diào)節(jié)作用。

本文臨床觀察36例宮內(nèi)應(yīng)用LNG-IUS治療子宮肌瘤，1例在放置1個(gè)月后脫落，考慮與子宮腔過(guò)大有關(guān)，因此對(duì)于肌瘤直徑>5.0cm，宮腔>9.0cm 者慎用此方法；置器患者肌瘤的體積未增大，1例在放置LNG-IUS后9個(gè)月行子宮肌瘤剔除術(shù)，術(shù)后繼續(xù)放置LNG-IUS，未出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象，提示LNG-IUS對(duì)子宮肌瘤有抑制其生長(zhǎng)及降低其復(fù)發(fā)的作用，與國(guó)外文獻(xiàn)結(jié)果相同[13]。由于患者是在刮宮去除大部分子宮內(nèi)膜后放置LNG-IUS，使得LNG對(duì)殘留的內(nèi)膜局部作用得以增強(qiáng)[14]，因此可使其置器后出血減少，患者更易接受；8例在放置后10個(gè)月閉經(jīng)，其余均為少量及點(diǎn)滴出血，患者血紅蛋白水平明顯提高，貧血癥狀得到改善，子宮容積較置器前縮小，且全身副作用較小。腫瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。LNG-IUS每天向?qū)m腔內(nèi)釋放20 μg LNG，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理濃度的孕激素水平及肌瘤組織中正常的黃體酮含量[15]，這種局部高濃度LNG是否為孕激素對(duì)肌瘤生長(zhǎng)的逆向調(diào)節(jié)作用目前尚不明確。為了尋求答案，本研究采用MTT法檢測(cè)LNG、E2對(duì)UtLMCs的增殖調(diào)節(jié)作用與藥物劑量及作用時(shí)間之間的關(guān)系，結(jié)果表明，濃度為5 μg/ml LNG對(duì)UtLMCs的增殖無(wú)明顯影響，但當(dāng)濃度增加至10 μg/ml后能明顯抑制細(xì)胞增殖，隨著LNG濃度的進(jìn)一步增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，該增殖抑制作用不斷增強(qiáng)，濃度為25 μg/ml時(shí)對(duì)UtLMCs 的24 h、48 h和72 h抑制率分別達(dá)20.48%、 21.10%和24.36%。與對(duì)照組相比，不同時(shí)點(diǎn)低濃度E2抑制UtLMCs的細(xì)胞活力，高濃度E2顯著增強(qiáng)UtLMCs的增殖活力。

腫瘤的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡失衡的結(jié)果。許多藥物可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起治療作用。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)加入LNG后子宮平滑肌瘤細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LNG濃度增至10 μg/ml后，子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡率顯著上升，并隨藥物濃度增加而增加。

綜上所述，LNG-IUS對(duì)子宮肌瘤有較好的臨床療效，其治療作用可能與局部高濃度LNG抑制肌瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肌瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。這也在一定程度上提示，孕激素在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中可能扮演著雙重角色。鑒于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的策略已成為近年來(lái)腫瘤治療的重點(diǎn)，后續(xù)仍需大量的研究來(lái)明確具體的分子機(jī)制。