郁金芬 李海燕 趙瑩琰 許 潔

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院(215600)

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊類型，其B超一般表現(xiàn)為妊娠囊形態(tài)不規(guī)則，枯萎塌陷或無心管搏動(dòng)[1]。近年來，隨著環(huán)境變化及高齡妊娠婦女增多等原因，稽留流產(chǎn)的發(fā)生率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)[2]。其病因極其復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道涉及了染色體、生殖道感染、畸形、內(nèi)分泌、免疫失衡、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、母胎界面循環(huán)、環(huán)境等諸多影響因素[3]。盡管目前人們對(duì)稽留流產(chǎn)的研究較多，但具體的病理機(jī)制尚未明確。本研究主要探討Hcy水平與炎癥因子在稽留流產(chǎn)中的作用及關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

以2015年12月—2016年8月來本院要求早孕負(fù)壓吸宮術(shù)或因稽留流產(chǎn)行清宮術(shù)的婦女為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：婦科檢查、B超或子宮輸卵管造影等檢查排除先天性生殖器官解剖學(xué)畸形或腫瘤；內(nèi)分泌功能正常(包括月經(jīng)周期正常、甲狀腺功能正常、無糖尿病史，無靜脈栓塞史，無肝、腎等急慢性疾病)；稽留流產(chǎn)婦女(稽留組)流產(chǎn)前超聲證實(shí)胚胎停育，且通過流產(chǎn)絨毛組織染色體檢測(cè)排除因染色體非整倍體異?；蚱沃貜?fù)或缺失引起的胎停；人工流產(chǎn)婦女(對(duì)照組)無自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎、胎盤栓塞等不良孕產(chǎn)史，且本次流產(chǎn)前超聲證實(shí)胎兒發(fā)育與孕周相符。入選婦女均簽署知情同意書。

1.2 血漿各指標(biāo)測(cè)定

用全自動(dòng)生化儀測(cè)定空腹胰島素，化學(xué)發(fā)光法測(cè)孕酮及三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)；葡萄糖氧化酶法測(cè)空腹血糖；用循環(huán)酶法檢測(cè)血漿Hcy，用放射免疫法測(cè)定血中葉酸濃度。正常人Hcy值是5～15μmol/L；正常人葉酸4.5～34nmol/L。胰島素抵抗指數(shù)(HOME-IR)=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

1.3 樣本準(zhǔn)備及熒光定量PCR(RT-PCR)

流產(chǎn)絨毛組織均取自清宮術(shù)，用QIAGEN公司的RNeasy Blood & Tissue試劑盒分批提取絨毛組織基因組 RNA，紫外分光光度計(jì)以O(shè)D260值確定RNA含量并稀釋，使其終濃度為1 μg/μl。混合待逆轉(zhuǎn)錄的各組分后，一步法在熱循環(huán)儀上42℃、60min逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，完成后按照RT-PCR各反應(yīng)組分比例混合后進(jìn)行反應(yīng)[4]，GAPDH作為管家基因進(jìn)行內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，且所有目的基因的表達(dá)量均為與GAPDH進(jìn)行歸一化后的相對(duì)循環(huán)閾值。引物見表1。

表1 RT-PCR引物列表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

稽留組72例，年齡(29.8±3.5)歲，妊娠次數(shù)(1.9±0.5)次；對(duì)照組133例，年齡(27.5±4.7)歲，妊娠次數(shù)(1.4±0.6)次。兩組婦女的孕周、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、HOME-IR及甲狀腺功能指標(biāo)(TSH、T3、T4)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.2 血漿Hcy與葉酸水平

稽留組Hcy水平為(6.2±3.3)μmol/L，葉酸水平為(14.3±5.8)nmol/L；對(duì)照組Hcy水平為(4.4±3.6)μmol/L，葉酸水平為(16.7±4.5)nmol/L。稽留組婦女的Hcy水平高于對(duì)照組(t=3.61，P=0.001)，而葉酸水平則低于對(duì)照組(t=3.21，P=0.002)。

2.3 炎癥因子mRNA表達(dá)水平

稽留組婦女流產(chǎn)組織中TNF-α、TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.33，P<0.001；t=9.19，P<0.001；t=5.29，P=0.001)，分別是對(duì)照組婦女的(4.3±0.4)、(2.3±0.5)和(1.9±0.4)倍。

2.4 Hcy水平與炎癥因子的相關(guān)性

用線性回歸分析相關(guān)性結(jié)果顯示，Hcy水平與炎癥因子TNF-α、TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(分別為r=0.86，P=0.007；r=0.78，P=0.036；r=0.75，P=0.024)；與葉酸水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.74，P=0.031)。

表2 兩組婦女臨床資料比較

3 討論

Hcy是甲硫氨酸(Met)的中間代謝產(chǎn)物，而Met是人體必需氨基酸之一。血漿中超過70%的Hcy與白蛋白結(jié)合，并以多種形式存在。Hcy代謝過程中有3個(gè)關(guān)鍵酶，分別是5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(MS)和胱硫醚β-合成酶(CBS)[5]。其代謝途徑有兩條，包括再甲基化和轉(zhuǎn)硫基途徑代謝，這兩條途徑使Hcy水平在體內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡，并處于相對(duì)安全的低水平(正常人群Hcy水平5～15μmol/L)。然而，當(dāng)MTHFR、MS和CBS 3種關(guān)鍵代謝酶活性或體內(nèi)葉酸水平過低時(shí)，可導(dǎo)致體內(nèi)的Hcy蓄積，從而使血漿Hcy水平升高[6]。體內(nèi)高濃度的Hcy水平具有細(xì)胞毒性和胚胎毒性，抑制胚胎發(fā)育或造成胚胎停育，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。已有研究報(bào)道，參與Hcy代謝途徑的各種酶如出現(xiàn)遺傳缺陷，則可能引起Hcy濃度升高，嚴(yán)重者可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥[7]。近期有臨床研究表明，每日服用400 μg葉酸就可以通過改善血管內(nèi)皮功能、降低氧化應(yīng)激、改善大動(dòng)脈彈性功能而利于血管收縮舒張功能的發(fā)揮，即提示葉酸可以顯著改善由于血漿Hcy水平過高導(dǎo)致的血管損傷[8]。本研究中，兩組無論Hcy平均水平還是葉酸平均水平均在正常范圍內(nèi)，但稽留組Hcy平均水平高于對(duì)照組，提示孕早期的胚胎停育與高水平的Hcy有一定關(guān)系。此外，稽留組葉酸平均水平低于對(duì)照組，提示Hcy 的相對(duì)高水平狀態(tài)可能與葉酸水平較低相關(guān)。

絨毛組織是早孕時(shí)期母體與胚胎直接接觸的部分，常用作稽留流產(chǎn)發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)象。妊娠期間，絨毛組織在非特異性免疫反應(yīng)中起了重要作用[9]。有研究指出，高水平Hcy與炎癥因子如TNF-α和IL-1β的表達(dá)升高密切相關(guān)[10]。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)活性的多效細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)、炎癥介導(dǎo)等作用，在機(jī)體的免疫防護(hù)和免疫病理?yè)p傷中起著雙重作用[11]。妊娠期TNF-α主要由胎盤和脂肪組織合成和分泌，隨著孕周的增加胎盤逐漸發(fā)育成熟，釋放入血的TNF-α量也逐漸增加，孕晚期達(dá)到最大分泌量[12]。TNF-α的異常激活將導(dǎo)致免疫平衡破壞從而引發(fā)流產(chǎn)。本研究中，稽留組婦女的TNF-α的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，且與Hcy水平呈正相關(guān)，提示高Hcy水平可能通過激活核轉(zhuǎn)錄因子來啟動(dòng)細(xì)胞粘附分子和趨化因子的表達(dá)，從而促炎因子的表達(dá)引起慢性炎癥反應(yīng)。

TLRs 在妊娠早期絨毛組織中的表達(dá)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而在妊娠晚期胎盤中表達(dá)量更高。當(dāng)妊娠母體發(fā)生感染時(shí)，機(jī)體能夠快速的發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。TLRs是一種跨膜蛋白受體，主要參與非特異性免疫反應(yīng)，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。它可以識(shí)別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子，激活NFkB轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)多種炎癥因子的表達(dá)，在慢性炎癥和代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[13]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人TLRs家族成員有11個(gè)，其中了解比較清楚的有TLR2、TLR4、TLR5和TLR9，人類胎盤和絨毛膜組織上主要表達(dá)和發(fā)揮作用的是TLR2和TLR4[14]。本研究結(jié)果顯示，流產(chǎn)絨毛組織中的TRL2和TLR4的mRNA表達(dá)水平在稽留組顯著高于對(duì)照組，且與Hcy水平呈正相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)婦女絨毛組織的Hcy水平升高，并可引起TNF-α、TRL2和TLR4的mRNA表達(dá)水平的升高，表明稽留流產(chǎn)可能與葉酸水平降低、Hcy水平升高引起炎癥因子釋放的免疫反應(yīng)相關(guān)，該結(jié)論為稽留流產(chǎn)的機(jī)制和治療提供了新的參考和思路。