覃太洲 徐克惠 劉 莉 許文明 李福平

1.四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院(610031)；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院；3.四川大學(xué)-香港中文大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室

目前臨床上對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)病因的研究多集中在胚胎和母體因素的探討，然而即使排除以上因素，仍有約50%RSA患者病因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)，傳統(tǒng)的男性精液檢查是精液常規(guī)分析，這種檢測結(jié)果波動較大，且其相關(guān)指標(biāo)與胚胎發(fā)育和流產(chǎn)的關(guān)系尚不確切。精子DNA完整性檢測具有較好的穩(wěn)定性及較低的生物變異度，對于男性生育能力的評估，其敏感度要優(yōu)于精液常規(guī)分析[1-2]?，F(xiàn)有研究表明：精子DNA損傷會降低精子的受精能力與胚胎的發(fā)育潛能，從而降低臨床妊娠率和增高自然流產(chǎn)率[3]。國外研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)精子DNA碎片指數(shù)(DFI)>30%時，精子染色體的非整倍體率明顯升高，自然受孕率很低，有時即使能受孕發(fā)育成胚胎，但大部分都在妊娠早期發(fā)生自然流產(chǎn)[3-4]。現(xiàn)已有大量研究表明了精子DNA損傷與排除女方因素的URSA的相關(guān)性[5-9]。并且精子DNA完整性檢測與精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性不大，很可能是一項(xiàng)獨(dú)立的精子質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)[5,8,10-11]。然而目前多數(shù)研究所采用的方法只能檢測精子DNA損傷的總體比例，無法區(qū)分DNA的單、雙鏈損傷。而不同損傷類型可能跟不同疾病的發(fā)生有一定關(guān)系，了解損傷的類型對于如何進(jìn)行修復(fù)也有很大的幫助。本次研究同時使用中性和堿性彗星實(shí)驗(yàn)來檢測精子DNA完整性與損傷類型，對精子DNA完整性與URSA的相關(guān)性進(jìn)行探討，并進(jìn)一步明確精子DNA損傷的類型與URSA的關(guān)系，為臨床可能的治療方法提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014年6月—2014年12月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的URSA女性的配偶作為流產(chǎn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：男女雙方外周血染色體G顯帶正常且無家族遺傳病史；非近親結(jié)婚；女方年齡<35歲；排除嚴(yán)重全身性疾病；女方無甲亢、甲減、多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥、黃體功能不全、糖尿病等內(nèi)分泌異常；女方無子宮發(fā)育畸形或?qū)m腔內(nèi)異常；女方抗磷脂抗體陰性；女方孕期無TORCH或其他生殖道感染，孕期無特殊藥物、毒物、放射線接觸史。同時收集有正常生育史的男性作為生育組。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～45歲；近18個月內(nèi)有正常致孕史，且配偶無妊娠3個月內(nèi)流產(chǎn)；無嚴(yán)重全身性疾病、傳染性疾病和精神?。患易逯袩o不育患者；排除泌尿生殖道感染和腫瘤病史，無生殖道發(fā)育缺陷、畸形及相應(yīng)手術(shù)史。

1.2 精液標(biāo)本采集及分析

按WHO推薦方法[12]采集精液,精液常規(guī)分析和DNA完整性分析均取用同一份精液樣本。采用清華同方精子、微生物動(靜)態(tài)圖像檢測分析系統(tǒng)(CASAS-QH-III)進(jìn)行精子常規(guī)參數(shù)分析，具體工作由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院精子庫實(shí)驗(yàn)室完成。主要檢測指標(biāo)包括精子濃度、總活力、前向運(yùn)動、正常形態(tài)精子百分率。其參考值參照參考文獻(xiàn)[12]。精液正常標(biāo)準(zhǔn)：精子濃度≥15×106/ml；總活力[前向運(yùn)動(PR)+非前向運(yùn)動(NP)]≥40%；前向運(yùn)動(PR)≥32%；正常形態(tài)精子百分率≥4%。

1.3 精子DNA完整性檢測

采用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)即彗星實(shí)驗(yàn)檢測精子DNA完整性。具體操作步驟參考美國TREVIGEN公司彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒提供的CometAssay操作手冊。本研究分別使用中性和堿性彗星實(shí)驗(yàn)，以區(qū)分DNA的單、雙鏈損傷。

1.3.1誘導(dǎo)單鏈DNA損傷(SSB)[13]用磷酸緩沖液(PBS)將1份生育組樣本精子密度稀釋至1×106/ml。將稀釋后標(biāo)本分成3份，每份300 μl，2份分別加入0.1%和0.3%的H2O2100 μl在室溫中孵育20 min，另外1份作陰性對照。后續(xù)步驟按彗星實(shí)驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。

1.3.2誘導(dǎo)雙鏈DNA損傷(DSB)[13]用PBS將1份生育組樣本精子密度稀釋至1×106/ml。浸入裂解液1 h后，浸入TBE中20 min。取出玻片后，用50μl 1×Buffer Tango孵育10 min。再將15μl 1×Buffer Tango混合15 U 限制性內(nèi)切酶Alu I覆蓋于載玻片上，蓋上蓋玻片，在37℃培養(yǎng)箱中分別孵育20和40 min。同時做陰性對照。用TBE浸泡10 min。后續(xù)步驟按彗星實(shí)驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。

1.4 彗星圖像分析軟件

采用CASP 1.2.3 beta2彗星圖像分析軟件。判斷精子DNA損傷程度[14-15]：①核熒光完整、強(qiáng)度高，彗星尾長<10 μm，為無損傷；②核熒光完整、強(qiáng)度較低，10 μm<彗星尾長<40 μm，為輕度損傷；③核熒光不完整、強(qiáng)度低或與彗尾不能明顯區(qū)分，彗星尾長>40 μm，為重度損傷。每份樣本計(jì)數(shù)500個精子。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)錄入Excel表格，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)、百分率表示，經(jīng)H2O2或AluI誘導(dǎo)精子DNA損傷類型的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。流產(chǎn)組與生育組的精液常規(guī)參數(shù)和精子DNA碎片化指數(shù)(DFI)的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基本情況

本次研究，流產(chǎn)組納入50例男性，年齡(29.6±4.6)歲(23～44歲)；生育組納入50例男性，年齡(30.5±4.9)歲(21～39歲)。

2.2 彗星圖像

本研究中，中性電泳檢測出的DNA雙鏈損傷(DSB)彗尾位于X軸，堿性電泳檢測出的DNA單鏈損傷(SSB)彗尾位于Y軸。具體分類見圖1。

A無損傷：核熒光完整、強(qiáng)度高，彗星尾長不超過10 μm；B輕度DSB：核熒光完整、強(qiáng)度低，彗尾位于X軸，10 μm<尾長<40 μm；C重度DSB：核熒光不完整、強(qiáng)度低或與彗尾不能明顯區(qū)分，彗尾位于X軸，尾長>40 μm；D輕度SSB：核熒光完整、強(qiáng)度低，彗尾位于Y軸，10 μm<尾長<40 μm；E重度SSB：核熒光不完整、強(qiáng)度低或與彗尾不能明顯區(qū)分，彗尾位于Y軸，尾長>40 μm圖1 精子DNA損傷的類型(10×20)

2.3 經(jīng)處理后精子的彗星實(shí)驗(yàn)

樣本經(jīng)H2O2處理后，精子DNA SSB明顯增多，H2O2作用的濃度越高，其單鏈DNA碎片指數(shù)(SSB-DFI)也越高，兩者正相關(guān)(r=0.702，P<0.001)。經(jīng)Alu I處理后，精子DNA DSB明顯增多，Alu I作用的時間越久，其雙鏈DNA的DSB-DFI也越高，兩者正相關(guān)(r=0.593，P<0.001)。見表1，圖2，3。

2.4 精液常規(guī)參數(shù)

精液常規(guī)參數(shù)對比，流產(chǎn)組的精子濃度[(91.0±56.8)×106/ml]低于生育組[(121.1±50.4)×106/ml](P<0.05)。兩組的前向運(yùn)動[(52.5±13.5)%，(54.3±10.8)%]、總活力[(58.9±12.7)%，(61.3±10.5)%]、正常形態(tài)精子百分率[(3.4±2.6)%，(3.3±2.2)%]差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 精子DNA完整性

精子DNA完整性對比，流產(chǎn)組擁有更高的精子DNA DFI[(29.5±4.3)%]和精子SSB-DFI[(19.0±3.8)%],與生育組[(18.2±3.5)%，(8.9±3.0)%]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而，兩者的精子DSB-DFI[(10.5±3.4)%，(9.2±2.4)%]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同處理后的精子堿性和中性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(例)

A:經(jīng)不同濃度H2O2處理后DSB-DFI和SSB-DFI的對比；B:經(jīng)不同作用時間AluI處理后DSB-DFI和SSB-DFI的對比圖2 經(jīng)H2O2或AluI處理后的DNA碎片化指數(shù)

A：未經(jīng)處理的DSB；B：用Alu I處理20 min后的DSB；C：用AluI處理40 min后的DSB；D:未經(jīng)處理的SSB；E：用0.1% H2O2處理后的SSB；F：用0.3% H2O2處理后的SSB圖3 經(jīng)H2O2或Alu I處理后的彗星圖像

3 討論

目前，用于精子DNA完整性檢測的技術(shù)較多，常用的有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA)；精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)(SCD)；DNA斷裂熒光原位雜交技術(shù)(DBD-FISH)；末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法(TUNEL)；8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定法等。但這些方法都有一個共同的缺點(diǎn)，那就是無法區(qū)分DNA損傷類型。本研究采用的彗星實(shí)驗(yàn)可根據(jù)電泳液酸堿性的不同將DNA單、雙鏈損傷區(qū)分開來，從而進(jìn)一步探尋精子DNA損傷類型與URSA的關(guān)系。

本研究中，精液常規(guī)參數(shù)對比，流產(chǎn)組的精子濃度明顯低于生育組，而前向運(yùn)動、總活力、正常形態(tài)精子百分率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國內(nèi)張麗紅等[16]對85例RSA患者配偶和50例正常生育男性的精液常規(guī)分析結(jié)果顯示，兩組的精子濃度、前向運(yùn)動、正常形態(tài)精子百分率兩組未見差異。國外Simon等[8]的研究也得出類似的結(jié)論。以上研究提示精子濃度可能與URSA有一定聯(lián)系，但由于精液常規(guī)參數(shù)波動范圍大，并不能準(zhǔn)確提示URSA的病因。

關(guān)于精子DNA完整性對比，流產(chǎn)組擁有更高的精子DNA碎片指數(shù)。這與之前的大部分研究結(jié)果相吻合[5-9]。精子DNA損傷過多會降低精子的受精能力與胚胎的發(fā)育潛能，從而降低臨床妊娠率和增高自然流產(chǎn)率。同時值得注意的是在對精子DNA損傷類型的區(qū)分中，流產(chǎn)組的精子單鏈DNA損傷率明顯高于生育組。而兩者的精子雙鏈DNA損傷率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這進(jìn)一步提示精子DNA的單鏈損傷可能是造成流產(chǎn)的重要因素之一。本研究與Ribas-Maynou等[17]2012年的研究結(jié)果不一致，他認(rèn)為過高的DSB造成了流產(chǎn)，而過高的SSB會導(dǎo)致不育，但該研究僅納入了20例RSA患者，樣本量較小。

DNA的單鏈損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)，而雙鏈損傷更多與內(nèi)源性核酸酶有關(guān)[18-20]。這也是本研究中使用H2O2誘導(dǎo)SSB，AluI誘導(dǎo)DSB進(jìn)行對照的原因。已有很多研究證實(shí)了活性氧類物質(zhì)(ROS)與RSA的關(guān)系，Shamsi等[21]對25例排除女性因素的RSA患者的配偶精液中ROS水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其平均值是正常生育組的9倍以上。Gil-Villa等[22]對23例RSA患者配偶精液的研究發(fā)現(xiàn)，與正常生育組相比，RSA組精液中脂質(zhì)過氧化水平更高，同時精漿的抗氧化能力也更弱。過量ROS或者機(jī)體抗氧化能力不足時，可直接氧化精子DNA堿基或發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成基因突變、易位、缺失，DNA單鏈斷裂[18]。如果大量的DNA單鏈損傷在卵裂期未能被完全修復(fù)，這可能導(dǎo)致胚胎染色體異常，從而發(fā)生流產(chǎn)[23]。

本研究還發(fā)現(xiàn)精子DNA的完整性比傳統(tǒng)的精液常規(guī)參數(shù)更能解釋URSA中男性所占的因素。曾有觀點(diǎn)[24]認(rèn)為精子形態(tài)學(xué)異常比例過高可能是導(dǎo)致URSA的原因。但本研究未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)組與生育組的正常形態(tài)精子百分率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國內(nèi)岳煥勛等[25]對185例URSA患者配偶的精液進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生URSA的患者精子畸形率并未高于正常生育者。國外Kahraman等[26]應(yīng)用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的胚胎染色體異常可能是來源于精子的染色體異常。Templado等[27]研究發(fā)現(xiàn)，精子形態(tài)學(xué)異常與精子染色體異常未表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性。而國內(nèi)徐秀民等[28]已證實(shí)，精子染色體非整倍體率與精子DNA損傷率呈顯著正相關(guān)。這都表明精子DNA的完整性與URSA可能有關(guān)聯(lián)，其比精子常規(guī)參數(shù)更能預(yù)測妊娠的結(jié)局。

目前，對于URSA，臨床上還沒有確切有效的治療方法。和本研究結(jié)果一樣，許多研究都已表明URSA患者的配偶精子DNA完整性與正常生育組有明顯差異。而輔助生殖技術(shù)中的精子體外優(yōu)選技術(shù)可以改善精子活力與形態(tài)，特別是上游法還可以回收DNA完整性較好的精子[29]。因此，可以嘗試對精子進(jìn)行上游法優(yōu)選后，再行宮腔內(nèi)人工授精(IUI)來治療URSA。國內(nèi)張洲等[30]運(yùn)用此法對33例URSA患者治療了79個周期，其中臨床妊娠14例，足月產(chǎn)12例，早產(chǎn)1例，流產(chǎn)1例。初步結(jié)果提示該治療方法可能有一定效果。本研究還發(fā)現(xiàn)精子DNA的單鏈損傷可能是造成流產(chǎn)的重要因素之一，而氧化應(yīng)激損傷又是導(dǎo)致DNA單鏈損傷的主要原因[18]，所以抗氧化治療可能對治療URSA有一定幫助。Gil-Villa等[31]選取了17例URSA患者的配偶，其中有9例被檢測出精子DNA損傷增加和脂質(zhì)過氧化，對他們進(jìn)行至少3個月的抗氧化藥物治療后，有6例獲得了成功的妊娠。

本研究應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)初步探尋了精子DNA損傷及不同的損傷類型與URSA的關(guān)系，并為臨床尋找可能的治療方法提供了新的思路。但由于病例數(shù)的限制，未來還有待更多樣本的檢驗(yàn)。精子DNA完整性對于精液質(zhì)量的評價(jià)、男性生育能力的評估和妊娠結(jié)局的預(yù)測能力似乎都要優(yōu)于精液常規(guī)分析。彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)由于能夠區(qū)分DNA損傷類型，被證明是一個有意義的臨床輔助診斷工具。由于彗星實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性，熟練的實(shí)驗(yàn)人員、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及更為敏感智能的圖像采集分析系統(tǒng)是提高結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。