吳保義， 陳正鵬， 李紅旺， 金春梅， 梁晚楓， 于龍政

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

犬新孢子蟲(Neosporacaninum)是一種專性細胞內寄生的頂復門原生動物寄生蟲，主要寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動物細胞內[1]。犬新孢子蟲侵入過程復雜，是多個蛋白質分子參與調控機制以及宿主細胞內多個因子相互作用而完成的。該過程包括蟲體對宿主細胞的識別和依附，入侵宿主細胞，在細胞內建立納蟲空泡并分裂增殖，納蟲空泡破裂蟲體釋放，再次入侵新的細胞。

酵母雙雜交技術主要是基于對酵母菌轉錄因子GAL4性質的研究設計而成，1989年由Fields等提出并初步建立[2]。該技術靈敏度非常高，目前在很多蛋白間關系鑒定試驗中已經廣泛應用[3]。Liu Q等[4]以TgGRA15為誘餌，將TgGRA15克隆到pGBKT7載體中并在Y2HGold酵母菌株中表達，篩選酵母雙雜交cDNA文庫，首次揭示了與TgGRA15相互作用的新的宿主細胞蛋白。新孢子蟲致密顆粒蛋白(dense granules proteins, GRAs)對納蟲空泡的形成及其功能的發(fā)揮具有重要作用。

本研究為了篩選出與新孢子蟲致密顆粒NcGRA7蛋白相互作用的宿主細胞蛋白質，構建并鑒定了誘餌載體pGBKT7-NcGRA7。

1 材料與方法

1.1 試劑

新孢子蟲Nc-1株，pGBKT7，pMD-19T(Simple)，DH5α保存于延邊大學農學院生物技術實驗室，DNA提取試劑盒，質粒DNA提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及EcoRⅠ、SalⅠ均購買于TaKaRa公司。2×Taq Master Mix購自北京佳蘭生物科技有限公司

1.2 引物設計與合成

依據(jù)GenBank中已經發(fā)表的新孢子蟲GRA7的基因序列，應用Oligo 6.0軟件設計引物NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF，在華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 新孢子蟲基因組DNA提取

將保存的蟲株復蘇并接種于Vero細胞，培養(yǎng)2～3 d，觀察到速殖子后根據(jù)TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取新孢子蟲株的基因組DNA。

1.4 PCR擴增NcGRA7基因

以提取的新孢子蟲株的DNA為模板，PCR體系為20 μL：NcGRA7-ES-fullR，NcGRA7-EN-commonF各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板 2 μL。

反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.5 pMD-19T(simple)-NcGRA7構建

將擴增出的目的片段用膠回收試劑盒進行回收后與pMD-19T(simple)連接，連接體系：NcGRA7 PCR產物 4.5 μL，pMD-19T (Simple)0.5 μL，Ligation SolutionⅠ5 μL。16 ℃連接12 h，連接產物轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞后涂布于Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，挑取單個菌落接種到Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，使用質粒提取試劑盒提取質粒，經過酶切鑒定后，陽性質粒送往生物公司測序，測序正確將其命名為pMD-19T(simple)-NcGRA7。

1.6 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7的構建

將測序成功的pMD-19T(simple)-NcGRA7質粒以及pGBKT7載體用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切，膠回收后，使用T4連接酶16 ℃連接12 h，將連接產物轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布于Kan抗性的LB固體培養(yǎng)基，經過挑菌，搖菌及酶切鑒定后將陽性質粒送往生物公司測序。

1.7 NcGRA7基因的序列比對

應用分子生物學軟件GENETYX對測序后的NcGRA7基因序列與GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因進行比對。

2 結果與分析

2.1 PCR結果

以新孢子蟲Nc-1株的DNA為模板，以NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF為引物擴增，PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到約570 bp片段，與預期大小一致(圖1)。

M：DL 2 000 Marker；1：擴增產物；2：空白對照

2.2 pMD-19T(simple)-NcGRA7酶切鑒定

將NcGRA7的PCR產物與pMD-19T(simple)連接后轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，構建的重組質粒經過PCR初步鑒定后，用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切鑒定，質粒切出目的條帶約為570 bp，與預期大小一致(圖2)。

圖2 pMD19T-NcGRA7質粒酶切鑒定

2.3 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7的酶切鑒定

用EcoRⅠ和SalⅠ分別對pMD-19T-NcGRA7以及pGBKT7進行雙酶切，膠回收后進行連接，轉化。經過PCR初步鑒定后得到陽性質粒，再進一步酶切鑒定，對陽性進行雙酶切，得到與之前一致的約570 bp大小片段(圖3)。

圖3 pGBKT7-NcGRA7質粒酶切鑒定

2.4 NcGRA7基因的序列比對分析

將去掉信號肽和疏水區(qū)的NcGRA7基因測序后，和GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因進行序列比對分析，結果表明，試驗所獲得的NcGRA7基因與GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因同源性100%(圖4)，可用于后續(xù)研究。

3 討論與結論

利用酵母雙雜交系統(tǒng)可以從cDNA文庫和基因文庫中篩選出與構建的誘餌載體所表達蛋白相互作用的蛋白，以此來得到相關的受體，并進一步繪制出蛋白質相互作用圖譜，可以增加對入侵機理的了解[5]。該試驗研究的NcGRA7基因序列中無內含子，其含有1個信號肽序列和1個跨膜區(qū)[6]，NcGRA7蛋白是一種新孢子蟲速殖子，其特異性表達的致密顆?？乖璠7]，相對分子質量約為33 ku，該蛋白中包括3個疏水區(qū)，其中，第3個疏水區(qū)是跨膜區(qū)，表明了NcGRA7對空泡的形成和膜的表面修飾起到一定的作用。NcGRA7蛋白在1998年由Jacobs等篩選得到[8]。Huang等通過ELISA鑒定得出NcGRA7可能在寄生蟲誘導的流產中起作用[9]。Jenkins等通過質粒DNA免疫研究證實了NcGRA7可以作為免疫原[10]。但目前對NcGRA7蛋白的具體功能缺乏了解。

為篩選出與NcGRA7相互作用的蛋白，進一步探索新孢子蟲入侵機理和制備疫苗，該試驗構建了酵母雙雜交誘餌載體。鑒于pMD19T(Simple)載體連接條件簡便、連接效率高，試驗將NcGRA7基因先與pMD19T(Simple)連接，獲得兩端有EcoRⅠ、SalⅠ黏性末端的NcGRA7基因后，再連接到pGBKT7載體上。

本試驗通過提取新孢子蟲Nc-1株的DNA，經過PCR擴增得到NcGRA7基因，并將其克隆到pMD19T(simple)載體。經過測序以及序列分析鑒定，與NCBI基因庫中的NcGRA7基因序列比對結果一致。再將得到的目的基因克隆到pGBKT7載體上，成功構建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7，為后續(xù)試驗酵母雙雜交鑒定奠定基礎。

圖4 NcGRA7基因的核苷酸序列比對