陳 洋，單雪松，呂文發(fā)*，趙志輝

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062）

顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成成分，可分泌多種卵泡發(fā)育所需因子，并通過旁分泌及間隙連接等方式調(diào)控卵母細(xì)胞的生長、分化和成熟[1]，顆粒細(xì)胞的存活或凋亡直接影響著卵泡的發(fā)育。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent Information Regulator1，SIRT1）是一種依賴于NAD+的組蛋白去乙?；福ㄟ^賴氨酸殘基去乙?；{(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，其作用底物包括FOXOs[2]、P53[3]、PGC1-α[4]、PPAR-γ[5]、NF-kB[6]等多種轉(zhuǎn)錄因子及蛋白。相關(guān)研究表明，SIRT1在哺乳動(dòng)物顆粒細(xì)胞中表達(dá)，通過參與顆粒細(xì)胞凋亡過程調(diào)控卵泡閉鎖退化[7]。Morita等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有促進(jìn)大鼠卵巢孕酮（P4）分泌的功能。Xiong等[9]研究表明，SIRT1表達(dá)下調(diào)抑制小鼠顆粒細(xì)胞的凋亡。SIRT1調(diào)節(jié)生殖過程的可能機(jī)制是通過促進(jìn)促性腺激素釋放激素（GnRH）、促黃體生成素（LH）釋放和誘導(dǎo)LH受體表達(dá)完成[8,10]，但其具體分子機(jī)制迄今尚未闡明。相關(guān)研究認(rèn)為，SIRT1對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能通過Bcl-2家族發(fā)揮功能[11]。

目前，SIRT1對(duì)動(dòng)物生殖功能調(diào)控的研究主要集中在小鼠和人類，對(duì)牛的研究相對(duì)較少。本研究構(gòu)建了牛SIRT1-shRNA表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細(xì)胞，探討SIRT1對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及雌激素分泌的影響，為揭示SIRT1基因在牛卵泡發(fā)育過程的作用及機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 屠宰場采集牛卵巢，37℃保溫帶回實(shí)驗(yàn)室，用滅過菌的剪刀剪掉卵巢周邊多余結(jié)締組織，預(yù)熱含雙抗的生理鹽水沖洗3遍，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 qPCR相關(guān)試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，Western Blotting試劑盒、蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、凋亡試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，兔抗人Bax、Bcl-2、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的二抗為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DMEM/F12、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，雌激素ELISA試劑盒為武漢基因美生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用帶16號(hào)針頭的10 mL無菌注射器抽吸卵巢上直徑為2～6 mm的卵泡，收集卵泡液至15 mL離心管中，400 r/min，離心5 min，取培養(yǎng)液重懸沉淀，分裝于培養(yǎng)皿中，加10%胎牛血清、37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染SIRT1-shRNA的干擾組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA的對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白組。將待轉(zhuǎn)染的顆粒細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到5×104/mL接種于6孔板中，用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，選取鋪板均勻且融合度在70%～80%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前用無血清、雙抗的DMEM/F12洗細(xì)胞2遍，再加入1.5 mL無血清、雙抗培養(yǎng)液，按照Lipofectamine 2000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 Trizol法提取干擾組、對(duì)照組和空白組顆粒細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參基因。結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見表2。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%胰酶消化收集孔中所有細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/孔，加入400 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后再加入5 μL Annexin V-FITC染液，輕輕混勻后避光孵育15 min，再加入10 μL PI上機(jī)檢測并分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.6 Western Blot檢測蛋白水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2遍，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解，收集6孔板內(nèi)的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，分別用相應(yīng)的一抗4℃封閉過夜，TBST充分洗滌3次，每次5 min，除去未結(jié)合的一抗。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫避光孵育1 h；TBST充分洗滌3次，每次5 min，ECL發(fā)光顯影。以β-actin為內(nèi)參。采用Image J軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.7 雌激素測定 轉(zhuǎn)染48 h后收集培養(yǎng)液，用雌激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測培養(yǎng)液中雌激素的濃度。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度。具體步驟參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，干擾組（圖1-A）和轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組（圖1-B）顆粒細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見熒光蛋白表達(dá)。

圖1 顆粒細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光蛋白表達(dá)情況（40×）

2.2 干擾后SIRT1基因?qū)崟r(shí)定量PCR結(jié)果 圖2顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染SIRT1-shRNA干擾組顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染NC-shRNA對(duì)照組顯著減少（P＜0.05）；對(duì)照組和空白組之間顆粒細(xì)胞的SIRT1 mRNA表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。

表1 合成的shRNA序列

表2 目的基因引物序列

圖2 不同處理組顆粒細(xì)胞SIRT1 mRNA的表達(dá)

2.3 SIRT1-shRNA對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（圖3、4）顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)照組和空白組顆粒細(xì)胞凋亡率顯著高于干擾組（P＜0.05），前兩者之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖 3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

圖4 不同處理組顆粒細(xì)胞凋亡率

2.4 SIRT1-shRNA對(duì)Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 由圖5可知，轉(zhuǎn)染48 h 后，干擾組顆粒細(xì)胞中Bax mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著低于對(duì)照組和空白組（P＜0.05），而干擾組顆粒細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組和空白組顯著升高（P＜0.05）。

2.5 SIRT1-shRNA對(duì)顆粒細(xì)胞雌激素分泌的影響 由圖6可知，轉(zhuǎn)染48 h后，干擾組顆粒細(xì)胞中雌激素分泌水平較對(duì)照組顯著減少（P＜0.05），對(duì)照組和空白組差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 不同處理組顆粒細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)

圖6 不同處理組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素分泌水平

3 討 論

卵泡發(fā)生發(fā)育過程中，小部分卵泡發(fā)育成熟排卵，大部分卵泡則閉鎖退化。卵泡的生長發(fā)育伴隨著卵泡中顆粒細(xì)胞的增殖與分化，卵泡閉鎖則起始于顆粒細(xì)胞凋亡。SIRT1是Ⅲ型組蛋白去乙?；窼irtuins家族的重要成員，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬、DNA損傷修復(fù)和代謝等生物過程中起著重要的調(diào)控作用[12-13]。越來越多的研究表明，在哺乳動(dòng)物中SIRT1信號(hào)通路可以抑制原始卵泡發(fā)育，減少卵泡閉鎖，從而增加卵泡儲(chǔ)備延長卵巢壽命[14]，在豬的卵母細(xì)胞中SIRT1表達(dá)量隨著年齡的增長而下降[15]。有研究表明，當(dāng)SIRT1缺失時(shí)，無論雌雄小鼠都喪失生育能力[16-17]。這說明SIRT1在生殖過程中起重要調(diào)控作用。SIRT1調(diào)控多種細(xì)胞類型的凋亡，但SIRT1在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育中的確切作用，特別是在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中的作用仍鮮為人知。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾SIRT1基因表達(dá)，顆粒細(xì)胞凋亡減少，這可能通過Bcl-2通路調(diào)節(jié)。通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，干擾SIRT1基因后顆粒細(xì)胞促凋亡基因Bax mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯低于對(duì)照組與空白組，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于對(duì)照組和空白組，提示SIRT1可能通過參與凋亡因子表達(dá)水平的調(diào)控，間接參與顆粒細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。Kuo等[18]研究表明，在人乳腺癌細(xì)胞中抑制SIRT1活性可下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而加速乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制乳腺癌進(jìn)展。以上結(jié)果說明SIRT1可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，也可以抑制細(xì)胞增殖，主要取決于細(xì)胞類型。本實(shí)驗(yàn)中，干擾組顆粒細(xì)胞中雌激素分泌水平與對(duì)照組和空白組比較降低明顯，這與李碧俠等[19]對(duì)豬的顆粒細(xì)胞研究結(jié)果相似。結(jié)果初步說明牛卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1基因表達(dá)量影響顆粒細(xì)胞雌激素分泌水平，具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，干擾SIRT1基因表達(dá)能夠抑制牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，且降低雌激素分泌。