駱金紅，苑洪霞 ，王 鑫，張 勇，陳 祥

（貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

白洗豬又稱苗寨豬，原產(chǎn)于施秉縣白洗鄉(xiāng)（今楊柳塘鎮(zhèn)），是貴州省東南部的一個地方豬品種[1]，具有肌纖維細膩、肌肉系水能力強[2]、不含氟烷基因[3]、生長緩慢、瘦肉率低[4]等特點。LYRM1 （LYR Motif Containing 1）基因是應用抑制性差減雜交技術從肥胖與正常人網(wǎng)膜脂肪組織中篩選出的差異性高表達基因，其開放閱讀框369 bp，定位于人染色體16P11.2，mRNA全長1 589 bp，包含3個內含子和4個外顯子，編碼122個氨基酸[5-6]，具有促進前體脂肪細胞增殖、抑制其凋亡的作用[6-7]，可為提高瘦肉率以改善白洗豬肉質提供參考[8]。對白洗豬LYRM1基因5個外顯子進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因不具多態(tài)性，在多個物種間進化上高度保守。與LYRM1基因一樣，LYRM2（LYR Motif Containing 2）基因也是LYR復合體1超家族成員[9-10]，定位于人類第6號染色體的長臂15區(qū)，在人類、小鼠、犬、大鼠和斑馬魚中高度保守，編碼88個氨基酸[9,11]。目前，關于白洗豬、DBF1（杜洛克與白洗豬的雜交一代）豬的LYRM1和LYRM2基因的研究較少。因此，開展白洗豬、DBF1豬的LYRM1和LYRM2基因的研究對白洗豬種質資源開發(fā)及利用具有較高的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從白洗豬種質資源保護中心選取10月齡健康白洗豬8頭、DBF1豬6頭，屠宰后立刻采集心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長肌，用錫箔紙包好并標記，保存液氮中，運回實驗室，轉入-80℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織RNA的提取與cDNA第1鏈的合成 采用Trizol法提取總RNA，HiFiScript cDNA第1鏈合成試劑盒逆轉錄mRNA獲得cDNA，均用超微量紫外分光光度計和凝膠電泳分別測量其濃度和純度。

1.2.2 引物的設計 根據(jù)GenBank提供的LYRM1基因序列（XM_005662096.2）、LYRM2基因序列（XM00 3121299.3）和GAPDH基因序列（NM_001206359.1）設計引物，引物由上海生物技術有限公司合成（表1）。

1.2.3 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化及反應 按照SYBR Green 1試劑盒推薦體系，在其他條件相同的情況下，對退火溫度和引物濃度進行摸索、優(yōu)化，篩選最佳退火溫度和引物濃度。反應體系為10 μL：Master mix 5.8 μL，上、下游引物各 0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL。95℃ 預變性10 min，95℃變性 13 s；58℃退火28 s；72℃延伸32 s，43個循環(huán)，95℃，15 s，最后從60℃到95℃按0.5℃增值進行熔解曲線分析，熒光采集時間為5 s。本實驗采用的最佳引物濃度為100 ng/μL，每個樣品進行3管平行實驗。

1.3 統(tǒng)計分析 應用 2-△△Ct法[12]分析 LRYM1、LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬的心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長肌中的表達水平。應用Excel 2013進行前期數(shù)據(jù)的排序等整理，應用SPSS 19.0中Duncan's法在0.01和0.05水平進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 組織 RNA的特異性檢測 提取RNA的A260/A280均在1.8～2.0，表明提取的RNA質量較好；凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)28 s、18 s條帶清晰、未出現(xiàn)拖尾和降解（圖1），滿足下一步實驗要求。

圖1 不同組織LYRM1、LYRM2和GAPDH基因提取RNA的凝膠電泳圖

2.2 LYRM1、LYRM2基因各組織PCR擴增產(chǎn)物的檢測用反轉錄獲得的組織cDNA為模板進行普通PCR擴增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物（圖2），可見產(chǎn)物清晰度高、特異性強，未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，且擴增片段與目的片段大小一致，可用于下一步實驗。

2.3 實時熒光定量PCR產(chǎn)物特異性 擴增反應結束后，LYRM1、LYRM2基因擴增曲線均呈現(xiàn)“S”形，無明顯上揚趨勢且整體平行性較好（圖3）；LYRM1、LYRM2基因熔解溫度分別是76.7、76.1℃，熔解曲線均呈單峰，無引物二聚體，無雜峰，符合實驗要求。

圖2 LYRM1、LYRM2和GAPDH基因普通PCR驗證凝膠電泳圖

圖3 LYRM1（左）、LYRM2（右）基因擴增曲線

2.4 LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬不同組織中的表達 LYRM1基因表達量的分析發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長肌中均有表達，在皮下脂肪組織中高表達，在背最長肌低表達（圖4）。

圖4 LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬8個組織中的相對表達量

LYRM1基因表達量在白洗豬中8個組織中高低順序為皮下脂肪＞腎＞肝＞胃＞脾＞肺＞心＞背最長肌，其中，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織（P＜0.01），其他各組織之間無顯著差異。LYRM1基因表達量在DBF1豬中高低順序為皮下脂肪＞肝＞胃＞腎＞肺＞心＞脾＞背最長肌，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織（P＜0.01），除皮下脂肪，胃、腎、肝表達量顯著高于心、脾、肺、背最長肌（P＜0.05），其中，肝與其他各組織達到差異極顯著水平（P＜0.01）。LYRM1基因表達量在白洗豬和DBF1豬各組織間均未達到差異顯著水平。

2.5 LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬組織中的表達LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬8個組織中均有表達，且表達趨勢為皮下脂肪組織中最高，背最長肌中最低，且皮下脂肪中表達量與其他各組織差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。在白洗豬中，LYRM2基因表達量高低順序為皮下脂肪＞脾＞肝＞腎＞肺＞心＞胃＞背最長肌，除皮下脂肪，脾、肝中表達量顯著高于心、胃、腎、肺、背最長?。≒＜0.05）。在DBF1豬中，LYRM2基因表達量高低順序為皮下脂肪＞腎＞肺＞胃＞肝＞心＞脾＞背最長肌；除皮下脂肪，胃、腎、肺中表達量顯著高于心、脾、肝、背最長肌（P＜0.05），其中腎中表達量與其他6個組織中表達量差異極顯著（P＜0.01）。白洗豬皮下脂肪中LYRM2基因表達量顯著高于DBF1豬（P＜0.05）。

圖5 LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬8個組織中的相對表達量

3 討 論

本實驗采用SYBR Green I熒光嵌合染料法[13-14]檢測白洗豬和DBF1豬LYRM1、LYRM2基因 mRNA的相對表達量，實驗熔解曲線呈單峰且無其他雜峰，表明所用引物特異性良好[15]。LYRM1基因是在人網(wǎng)膜脂肪組織中高度表達的基因，具有抑制前體脂肪細胞的凋亡、促進前體脂肪細胞增殖的功能[6]。但是，LYRM1基因過表達則會下調3T3-L1 脂肪細胞中線粒體的代謝關鍵酶基因表達水平，提示LYRM1基因可能參與調節(jié)脂肪細胞線粒體的代謝，從而影響脂肪細胞的凋亡和增殖[16]。張翔等[17]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能通過降低LYRM1 mRNA水平來抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖。邱潔等[5]應用在線分析工具分析LYRM1基因的mRNA序列，發(fā)現(xiàn)存在多個與肥胖密切相關的轉錄因子結合位點，提示該基因可能受到其他脂代謝調節(jié)基因的調控。Li等[18]發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因可能通過脂肪沉積對秦川牛肉質性狀有潛在的影響，可用于標記輔助選種。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，LYRM1 mRNA在白洗豬和DBF1豬心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長肌均有表達，總體趨勢趨于一致，均在皮下脂肪組織中表達最高，背最長肌組織中表達最低，與邱潔等[6]的研究結果相一致。白洗豬皮下脂肪組織中LYRM1基因表達水平均高于DBF1豬，推測白洗豬瘦肉率低可能與LYRM1基因高表達有關，雜交有望提高DBF1豬瘦肉率。

LYRM2和LYRM1基因同是LYR復合體1超家族成員[9-10]，這個家族被認為可能參與了真核細胞NADH復合體的組成。本實驗發(fā)現(xiàn)，LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬中均有表達，且在皮下脂肪組織中表達最高，背最長肌中表達最低，與LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬中表達情況類似。白洗豬和DBF1豬皮下脂肪組織中，LYRM1基因表達量均高于LYRM2，推測LYRM1基因在皮下脂肪沉積中較LYRM2基因發(fā)揮著更大的作用。

4 結 論

本實驗研究顯示，LYRM1和LYRM2基因表達均高于白洗豬和DBF1豬的皮下脂肪組織，相對低于背最長肌，且表達趨勢趨于一致，LYRM1基因在白洗豬皮下脂肪組織中表達水平略高于DBF1豬，LYRM2基因在白洗豬皮下脂肪組織中的表達水平顯著高于DBF1豬。本研究結果表明，LYRM1與LYRM2基因可能為影響豬脂肪沉積的候選基因。