朱慶曦，黃曉東，劉蒙，韓崢，譚潔，劉維潔，陳巍，田霞

[武漢大學(xué)同仁醫(yī)院（湖北省武漢市第三醫(yī)院) 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060]

結(jié)腸癌是全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，居世界癌癥相關(guān)致死率的第2位，每年約70萬(wàn)患者死于結(jié)腸癌。目前結(jié)腸癌的治療是以手術(shù)切除為主的綜合治療，化學(xué)治療為輔，但是大多數(shù)患者在治療后容易復(fù)發(fā)[1]。市面上有多種抗腫瘤藥物，其中那可丁作為一種外周性鎮(zhèn)咳藥，能抑制肺牽張反射引起的咳嗽[2]。其可通過(guò)與微管結(jié)合、線粒體途徑誘導(dǎo)部分腫瘤或影響正常細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3-5]。盡管實(shí)驗(yàn)證實(shí)那可丁沒(méi)有明顯的毒副作用[6-7]，但是腫瘤細(xì)胞存在對(duì)那可丁產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題。本研究主要探索如何增強(qiáng)那可丁抗腫瘤的作用，同時(shí)降低其耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

那可丁（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料SYBR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Western blot檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin V、碘化物（propidium iodide，PI）購(gòu)自美國(guó)BioVision公司。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 通過(guò)軟件設(shè)計(jì)合成4組針對(duì)靶向基因肝腸鈣黏連蛋白（liver-intestine cadherin，CDH17）的pre-siRNA干擾序列，構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的siCDH17干擾質(zhì)粒，鑒定正確后轉(zhuǎn)染那可丁耐藥性結(jié)腸癌細(xì)胞，選出干擾效果最好的RNA干擾序列，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體。最終成功完成siCDH17（陽(yáng)性干擾組）和siNC（非特異性對(duì)照組）慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，慢病毒載體感染細(xì)胞感染率高達(dá)95%，并且作用時(shí)間長(zhǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR） 以 人 β-actin作為內(nèi)參，CDH17正向引物：5’-GGACAGAGAAGC CGGAAGTC-3’；反向引物 5’-GAACAAGCCCGTG TAGTCCTT-3’。根據(jù)SYBR Premix Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸8 min，最后保存于4℃。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 藥物作用時(shí)間結(jié)束后，收集細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞裂解提取并測(cè)定總蛋白濃度。取40μg蛋白加熱變性10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加脫脂奶粉封閉，4℃過(guò)夜。使用TBST洗滌3次，分別加入一抗CDH17（ab109190）（1∶1 000）和GAPDH（ab9485）（1∶2 500）抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1∶5 000），25℃孵育1 h，使用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，X射線片曝光。每份樣品檢測(cè)重復(fù)3次。

1.2.4 腫瘤異種移植模型 將裸鼠隨機(jī)分成空白組、非特異性對(duì)照組、陽(yáng)性干擾組，每組7只。在裸鼠右側(cè)背部皮下接種人結(jié)腸癌細(xì)胞懸液，復(fù)制裸鼠移植瘤模型，當(dāng)瘤體積達(dá)100～150 mm3時(shí)，每3天注射5 mg/kg那可丁，同時(shí)每3天觀察移植瘤生長(zhǎng)情況，進(jìn)行瘤重和瘤體積的比較。

1.2.5 末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL） 采用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將材料用二甲苯浸洗2次，5 min/次，過(guò)梯度酒精，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2次，用細(xì)胞通透液處理8 min，PBS漂洗3次，加入蛋白酶K，雙蒸水漂洗后用3%過(guò)氧化氫封閉，加入dUTP和過(guò)氧化氫酶培養(yǎng)后進(jìn)行觀察。當(dāng)基因組DNA斷裂時(shí)，在暴露的3’端加入異硫氰酸熒光素，通過(guò)熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體干擾CDH17的表達(dá)

2.1.1 CDH17 mRNA 空白組、非特異性對(duì)照組、陽(yáng)性干擾組的CDH17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，非特異性對(duì)照組與空白組CDH17 mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性干擾組與空白組比較，CDH17 mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

2.1.2 CDH17蛋白 空白組、非特異性對(duì)照組、陽(yáng)性干擾組的CDH17蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，陽(yáng)性干擾組的CDH17蛋白表達(dá)受到抑制，較空白組和非特異性干擾組降低（P＜0.05）；非特異性對(duì)照組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。mRNA和蛋白水平結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體成功干擾CDH17的表達(dá)。見(jiàn)表1和圖1。

2.2 下調(diào)CDH17基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

2.2.1 腫瘤體積 空白組、非特異性對(duì)照組、陽(yáng)性干擾組腫瘤異種移植模型在移植后2、4、6、8、12和16 d的腫瘤體積比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤體積有差別（F=14.582，P=0.000）。從第6天開(kāi)始，陽(yáng)性干擾組與空白組、非特異性對(duì)照組腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陽(yáng)性干擾組腫瘤體積大于空白組和非特異性對(duì)照組。②3組動(dòng)物體內(nèi)腫瘤體積有差別（F=189.081，P=0.000），陽(yáng)性干擾組較空白組、非特異性對(duì)照組動(dòng)物體內(nèi)腫瘤體積?。≒＜0.05），抑瘤效果較好；非特異性對(duì)照組與空白組動(dòng)物體內(nèi)腫瘤體積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③3組腫瘤體積變化趨勢(shì)有差異（F=5.731，P=0.018）。見(jiàn)表2和圖2。

表1 各組CDH17 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較 （n =7，±s）

表1 各組CDH17 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較 （n =7，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與非特異性對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別 CDH17 mRNA CDH17蛋白空白組 1.002±0.068 0.861±0.006非特異性對(duì)照組 0.910±0.085 0.851±0.008陽(yáng)性干擾組 0.217±0.0761）2） 0.229±0.0091）2）F值 94.676 4165.432 P值 0.000 0.000

圖1 慢病毒載體干擾CDH17蛋白的表達(dá)

2.2.2 腫瘤重量 移植后16 d，空白組、非特異性對(duì)照組、陽(yáng)性干擾組動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤重量分別為（0.956±0.023）、（0.908±0.026）和（0.321±0.037）g，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)意義（F=304.337，P=0.000），陽(yáng)性干擾組腫瘤重量低于空白組和非特異性對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

2.3 下調(diào)CDH17基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡

利用慢病毒表達(dá)載體干擾結(jié)腸癌細(xì)胞，與空白組結(jié)腸癌細(xì)胞和慢病毒干擾載體結(jié)腸癌非特異性對(duì)照組相比，TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性干擾組腫瘤異種移植模型體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多。見(jiàn)圖4。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤體積比較 （n =7，mm3，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤體積比較 （n =7，mm3，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與非特異性對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別 2 d 4 d 6 d 8 d 12 d 16 d空白組 107.712±17.371 206.997±27.176 339.189±32.375 614.772±79.036 923.893±80.393 1382.926±92.188非特異性對(duì)照組 106.418±15.147 205.290±26.383 333.373±29.674 593.399±64.778 912.509±60.511 1299.444±74.942陽(yáng)性干擾組 107.781±14.307 207.926±20.681 238.861±25.7011）2） 256.232±49.5841）2） 288.722±58.9791）2） 303.473±56.5291）2）

圖2 各組動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤體積不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)（±s）

圖3 各組動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤重量比較 （n =7，±s）

圖4 各組細(xì)胞凋亡情況 （×200）

3 討論

近年來(lái)結(jié)腸癌患者的生存率無(wú)明顯改善，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，每年新增900萬(wàn)確診病例，其中東歐、南美和東亞地區(qū)發(fā)病率最高[8]。我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率較高，其致死率高于其他惡性腫瘤[9]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以及人類對(duì)疾病與基因關(guān)系認(rèn)識(shí)的提高，聯(lián)合化學(xué)治療的基因治療得到越來(lái)越多的認(rèn)可?；瘜W(xué)基因治療可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性，而腫瘤基因治療即針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的遺傳性背景，明確缺失、突變等缺陷基因的作用，過(guò)表達(dá)或者下調(diào)腫瘤細(xì)胞，以及其他體細(xì)胞中特定基因已補(bǔ)償或者糾正錯(cuò)誤基因，達(dá)到治療腫瘤的目的。

細(xì)胞間的黏附機(jī)制在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起雙重作用。一方面腫瘤細(xì)胞必須先從其原發(fā)病灶黏附部位脫離，故黏附可抑制侵襲；另一方面，腫瘤細(xì)胞需要從連續(xù)的黏附和去黏附過(guò)程中獲得牽引力來(lái)進(jìn)行移動(dòng)。細(xì)胞黏附分子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，起至關(guān)重要的作用。CDH17是鈣黏連蛋白超家族中結(jié)構(gòu)特殊的一員，是對(duì)經(jīng)典鈣黏連蛋白和橋粒鈣黏連蛋白功能的補(bǔ)充，CDH17通常在人腸道上皮細(xì)胞及部分胰管上皮細(xì)胞中表達(dá)[10-11]。目前還沒(méi)有CDH17在正常人結(jié)腸癌中表達(dá)的報(bào)道，而其在胃癌、肝癌中都有表達(dá)[12-14]，這說(shuō)明CDH17可能在腫瘤進(jìn)程中扮演重要角色，與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

近幾年國(guó)內(nèi)針對(duì)那可丁對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響有所研究，有研究者通過(guò)那可丁聯(lián)合順鉑作用于體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示那可丁可以協(xié)同順鉑作用于SKOV3細(xì)胞，并提高順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的敏感性[15]。在針對(duì)卵巢癌的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，那可丁可以通過(guò)抑制介導(dǎo)腫瘤生存的關(guān)鍵因子—低氧誘導(dǎo)因子-1，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[16]。已經(jīng)證實(shí)，那可丁作為抗癌新藥能通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但具有耐藥性，如何能增強(qiáng)那可丁抗腫瘤的作用，同時(shí)降低其耐藥性是本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容。

本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物模型探討下調(diào)CDH17基因表達(dá)對(duì)那可丁耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從基因和蛋白水平分別驗(yàn)證siCDH17慢病毒載體的成功構(gòu)建。小鼠模型是可以進(jìn)行腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究的主要方法，涉及各個(gè)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，siCDH17對(duì)動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有較好的抑制作用。為研究siCDH17對(duì)耐藥性結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，采用TUNEL結(jié)合Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性干擾組細(xì)胞凋亡數(shù)量遠(yuǎn)多于其他兩組。有研究發(fā)現(xiàn)，CDH17的表達(dá)與人胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌有相關(guān)性，CDH17的表達(dá)水平在腸型癌癥組織中比肝、胃型癌組織要高[10]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)CDH17基因?qū)δ强啥∧退幍慕Y(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)在早期細(xì)胞的凋亡及后續(xù)發(fā)展上。本研究在分子水平上探討CDH17在耐藥性腫瘤中的作用，是對(duì)臨床治療腫瘤新藥物耐藥性的研究，也是對(duì)前人在腫瘤分子機(jī)制方面研究的基礎(chǔ)上，在臨床藥物方面的延伸，為臨床治療耐藥性腫瘤提供相關(guān)數(shù)據(jù)及研究方向。