胡夢華，王晶，余秋穎，張浩，樊劍鳴，王方雨

（1.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州河南 450002）(2.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，鄭州河南 450001）

β腎上腺素受體激動劑（俗稱“瘦肉精”）的違禁添加一直是威脅我國人群健康的問題之一，嚴重影響畜類食品安全和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。尤其近年來添加劑的混合使用以及新型結構類似物的出現增加了檢測的難度，因此開發(fā)一種β受體激動劑多殘留快速檢測技術成為了迫切需求。受體分析法是一種針對結構功能相似的目標物的類特異性快速檢測方法，可實現β受體激動劑類藥物的多殘留檢測以及對未知物的篩查[2]。作為受體分析法的核心識別元件，體外表達的β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）的活性和純度一直是研究焦點?，F有的研究表明，在大腸桿菌[3]、酵母[4]、昆蟲細胞[5]、哺乳動物細胞[6]和無細胞表達系統(tǒng)[7]等均能得到具有一定活性的受體蛋白，但表達量及蛋白活性在不同的表達系統(tǒng)中具有差異性。

分子對接技術是根據配體與受體作用的“鎖鑰原理”（lock and key principle），模擬它們的相互作用，使兩者結合形成低能構象，是藥物虛擬篩選的重要手段[8]。實驗表明，通過分子對接技術，可對多種乙酰膽堿酯酶與不同農藥分子的敏感性進行了虛擬篩選[9]；利用構建的GPCRs模型可以捕捉結合口袋的關鍵化學結構特點[10]；可用于篩選抗HIV-1逆轉錄酶活性化合物[11]，在中藥研究方面也有其獨特的優(yōu)勢[12,13]。

本研究利用分子對接技術，對β2AR受體蛋白的分子結構進行優(yōu)化，基于優(yōu)化后的分子結構人工合成基因，利用常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)，將成功構建的重組表達質粒，轉入BL21大腸桿菌，經IPTG誘導表達后，將誘導表達的受體蛋白利用組氨酸標簽蛋白純化磁珠進行蛋白純化，并對純化后受體蛋白進行活性鑒定，為建立基于受體分析法的β激動劑快速檢測技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和細胞

pET32a質粒由本實驗室保存；BL21（DE3）感受態(tài)細胞，購自天根生化科技（北京）有限公司；JM109感受態(tài)細胞，購自Takara公司。

1.2 試劑和材料

T4連接酶和ExTaq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內切酶NdeⅠ和XholⅠ購自美國NEB公司；小提質粒試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司；組氨酸標簽蛋白純化磁珠購自海貍生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidate，HRP）標記的克倫特羅來自Sigma公司；羊抗鼠二抗、His鼠源單克隆抗體購自Qiagen公司。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L）；PBST 洗液（PBS∶Tween20=2×103∶1），包被緩沖溶液（carbonate buffered saline，CBS，0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液），封閉液（PBST∶BSA＝100∶1），終止液（2 mol/L H2SO4）；其他常規(guī)試劑均為國產分析純級別。

1.3 方法

1.3.1 分子對接

對接所需的β受體激動劑分子結構均從ZINC上下載，β2AR蛋白分子結構（2RH1），從PDB數據庫中下載。依據2RH1的分子結構，對接口袋設定為包含Asp113、Asn312、Ser203、Phe193、Phe289、Phe290、Val114、Val117、Trp109、Tyr308、Tyr316、Tyr199、Trp286和Thr118殘基的區(qū)域，Threshold定義為0.50，Bloat定義為10A。以上述蛋白的對接區(qū)域作為受體，以β受體激動劑類小分子藥物作為配體，借助SYBYL軟件中FlexX方法進行對接工作，對接前先對β2AR進行系列優(yōu)化：提取出配體分子對側鏈的修補、主鏈末端的處理，加氫、刪除水分子、指定原子類型、加電荷和能量優(yōu)化等均按 SYBYL默認值進行系列優(yōu)化；利用SYBYL軟件的蛋白質對接下面的Define來生成對接活性口袋，其它條件按SYBYL默認值。以對接結果中總評分值（Total Score）為最終判斷對接結果的依據。

1.3.2 重組質粒的構建與鑒定

依據對接實驗中β2AR受體蛋白的分子結構，將人工合成并改造的β2AR基因PCR擴增后與表達載體pET32a分別用NdeⅠ和XholⅠ進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段和載體片段。在 T4連接酶的作用下，16 ℃連接過夜。將陽性重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗證讀碼框的正確性。序列正確的重組質粒命名為pET32a-β2AR1，并將重組質粒轉入BL21大腸桿菌。挑選氨芐陽性的單菌落搖菌，用于目的蛋白的表達。

1.3.3 表達條件的優(yōu)化及鑒定

將篩選出的BL21大腸桿菌菌液二次活化后1∶100接入加入氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，至細菌生長對數期（OD=0.6～0.9）。取出一部分菌液作為陰性對照，余下的菌液按終濃度為1 mmol/L，0.8 mmol/L，0.6 mmol/L和0.4 mmol/L加入誘導劑IPTG，37 ℃，誘導14 h后，將誘導表達的菌液超聲破碎，將破碎后菌液進行SDS-PAGE鑒定，檢測誘導表達的情況。

1.3.4 蛋白純化及活性鑒定

在2 mL EP管中加入1 mL菌液上清，組氨酸標簽蛋白純化磁珠400 μL，4 ℃環(huán)境下，在搖床上結合反應1 h，在磁力架上進行磁性分離，保存分離液，并用濃度10 mmol/L～500 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫受體蛋白，收集不同濃度咪唑洗脫液并進行SDS-PAGE檢測。將含有受體蛋白的洗脫液用透析液進行梯度透析，得到純化蛋白。CBS包被純化后受體蛋白，5%BSA封閉液封閉過夜，ELISA檢測目的蛋白的活性。

1.3.5 多殘留檢測曲線建立

純化蛋白1∶1稀釋后包被在酶標板，50 μL/孔。加入梯度稀釋的克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅3種β受體激動劑標準品（0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL），50 μL/孔。同時加入 1∶500 稀釋的 HRP-克倫特羅，50 μL/孔。37 ℃，30 min，PBST洗板，加入顯色液，100 μL/孔，顯色10 min，加入終止液，50 μL/孔，終止反應，酶標儀測各孔OD值。

1.3.6 交叉反應率的測定

根據標準曲線中的標準曲線公式，得到3種β受體激動劑的IC50值，計算3種β受體激動劑的交叉反應率（CR）。

計算公式：CR=[IC50(克倫特羅)/IC50(β受體激動劑)]

2 結果與分析

2.1 分子對接結果

圖1 β2AR與β受體激動劑類藥物分子對接模型圖Fig.1 Modeling diagram of β2AR and β adrenergic receptor agonists by molecular docking

表1 分子對接結果Table 1 Result of molecular docking

β2AR蛋白分子結構（2RH1）與15種β受體激動劑進行分子對接后，以總評分值（Total Score）作為判斷對接結果的依據，分子對接圖如圖1所示，分子對接結果如表1所示，β2AR受體蛋白在分子結構上能與多種β受體激動劑結合，并且其結合能力具有差異性。

2.2 重組表達質粒的鑒定

圖2 重組表達質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant expression plasmid

用限制性內切酶NdeⅠ和XholⅠ對重組表達質粒pET32a-β2AR1進行酶切鑒定，結果如圖2所示，重組質粒經酶切之后出現兩個條帶，在1500 bp左右出現目的條帶為β2AR基因片段，與預期片段大小相符，另一條為載體pET32a基因片段。

2.3 表達條件的優(yōu)化及鑒定

圖3 重組質粒誘導表達SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE image of recombinant expression plasmid

將重組表達質粒轉入BL21大腸桿菌，挑選Amp陽性的單菌落搖菌，分別標記為 1號菌，2號菌，3號菌和4號菌，誘導溫度設置為37 ℃，IPTG的濃度設置為 1 mmol/L，0.8 mmol/L，0.6 mmol/L和 0.4 mmol/L，將誘導和未誘導表達后的菌液超聲破碎后，SDS-PAGE檢測結果如圖3所示，誘導后的1號和2號菌在47 ku左右條帶明顯，3號和4號菌誘導后有目的蛋白的表達，但是條帶不明顯。

2.4 蛋白純化及活性鑒定

2.4.1 表達蛋白的純化

圖4 不同咪唑濃度洗脫蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE image of purified porcine β2AR protein eluted with different imidazole concentration

選取誘導表達較好的1號，2號菌液，經超聲破碎、離心后留取上清，加入400 μL的磁珠進行蛋白的純化，用不同濃度的咪唑洗脫液經SDS-PAGE檢測后如圖4所示，菌液均在濃度為300 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。

2.4.2 純化蛋白的活性鑒定

將純化后的受體蛋白采用 ELISA方法進行其活性鑒定，受體蛋白與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均能夠特異性結合，結果如表 2所示，pET32a-β2AR1表達的受體蛋白與三種激動劑的結合力最高的是IPTG為1 mmol/L，OD值分別為0.45、0.32、0.36。

2.4.3 多殘留檢測曲線建立

圖5 不同激動劑的檢測曲線圖Fig.5 Testing curve of different β receptor agonists

包被純化后的蛋白，ELRA方法檢測受體蛋白對三種激動劑的檢測能力，測得OD值以B/B0為縱坐標，以每種β受體激動劑濃度的對數值為橫坐標，建立檢測標準曲線。結果如圖5所示，R2均大于0.9，受體蛋白對克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均表現出一定檢測能力，尤其對克倫特羅的檢測能力最高。

2.4.4 交叉反應率測定

3種β受體激動劑的標準曲線公式和R2值分別列出，計算它們的IC50值，得到交叉反應率。結果如表3所示，萊克多巴胺和非諾特羅與克倫特羅的交叉反應率分別為5.45%和66.16%。說明本次實驗中表達的受體蛋白對β受體激動劑有一定的檢測能力。

表2 表達蛋白活性鑒定結果Table 2 Result of molecular docking

表3 交叉反應率測定結果Table 3 Determination of 3 β adrenergic agonists of by ELRA

3 討論

目前針對動物源性食品中多種β受體激動劑殘留量檢測，主要包括確證分析法和快速檢測法兩類。國家標準中規(guī)定了液相色譜-串聯質譜的測定方法，屬于確證分析方法[14～16]。具有耗時長、成本高、難以實現現場檢測等缺點?；诿庖邔W技術的快速檢測方法[17～20]只能針對特定的β受體激動劑進行檢測，因此不能滿足市場對快速檢測的需求。基于受體分析法的快速檢測雖能對β受體激動劑類藥物進行檢測，目前還處在研究階段[21,22]。

近年來，分子對接技術在藥物[23]、化學[24]及其他領域[25]得到迅速發(fā)展，隨著 GPCRs模型的建立及β2AR蛋白分子結構的發(fā)現，對它們的研究內容也更加廣泛[26]?；谶@些研究，本實驗對β2AR蛋白與β受體激動劑的相互作用進行分析，利用分子對接技術實現β2AR基因的人工改造。

由于天然的β2AR在生物體內的含量低且難于分離，為了獲取純度高、活性好的β2AR，近年來人們嘗試幾乎所有的體外表達系統(tǒng)，均表達出具有一定活性的受體蛋白。本次實驗在大腸桿菌成功表達的β2AR受體蛋白雖比以往其他系統(tǒng)表達的蛋白活性低，但比較其他大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究[3]，本實驗得到了活性較高的受體蛋白。并且利用分子對接技術實現對β2AR基因的改造，為β2AR基因的人工改造提供新的思路，為實現β受體激動劑的快速檢測奠定了理論基礎。

4 結論

本實驗利用分子對接技術對β2AR基因進行改造，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達出具有活性的β2AR受體蛋白，ELISA進行其活性鑒定結果顯示，β2AR受體蛋白與克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均能夠特異性結合，OD值分別為0.45、0.32、0.36，與分子對接結果基本一致。多殘留檢測曲線顯示，該β2AR受體蛋白具有一定的檢測β受體激動劑的能力，這為β2腎上腺素受體在β受體激動劑的快速檢測方面提供新的思路。