唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯(lián)，唐夢(mèng)君，張小燕，陳大偉，高玉時(shí)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

隨著人民生活水平的不斷提高，食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步得到完善和更新，然而食品摻假摻雜手段也在不斷提高[1]。近年來，在利益驅(qū)動(dòng)下肉制品摻假事件時(shí)有發(fā)生，“掛鵝頭賣鴨肉”、非法添加“牛肉膏”等食品安全事件不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者權(quán)益。2017年3月22日，南方網(wǎng)報(bào)道黃記煌使用過期變質(zhì)摻假肉事件。2016年12月12日，廣州市消委會(huì)發(fā)布消息稱海欣牌香港撒尿肉丸（牛肉風(fēng)味）和大魚市撒尿肉丸（牛肉味）中均沒有牛肉。2015年11月4日，法制晚報(bào)報(bào)道華潤(rùn)萬家社區(qū)超市出售摻假肉包子事件。2014年1月26日，羊城晚報(bào)報(bào)道市場(chǎng)出售摻假羊肉卷有70%是豬肉?？梢姡馀c肉制品摻雜摻假已成為我國(guó)食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)之一，而對(duì)原料肉進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定顯得十分必要。

傳統(tǒng)的方法是依靠感官評(píng)價(jià)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行肉類來源鑒別，但這些手段已遠(yuǎn)不能滿足監(jiān)管部門對(duì)肉制品摻假現(xiàn)象的監(jiān)控。目前，動(dòng)物源性食品鑒定的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[2]、電子鼻技術(shù)[3]、色譜法[4]以及分子生物學(xué)法[5～7]等。其中，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)憑借其特異性好、自動(dòng)化程度高，檢測(cè)周期短以及擴(kuò)增目的片段較小等優(yōu)勢(shì)，提高了食品中動(dòng)物源性成分定性鑒別的有效性，已逐步成為肉類種屬檢測(cè)和鑒定的核心方法[8,9]。孫晶瑩等[1]根據(jù)牛線粒體 DNA片段，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物，分別以生牛肉、熟牛肉及超市牛肉加工品為實(shí)驗(yàn)材料，建立了肉制品中牛源性成分多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。林彥星等[10]根據(jù)鴨mtDNA COX基因保守序列設(shè)計(jì)了鴨特異性引物和TaqMan探針，建立了畜禽肉制品中鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

動(dòng)物線粒體基因組DNA序列由于拷貝數(shù)多、在食品加工過程未完全降解以及高度物種特異性等特點(diǎn)，已成為肉與肉制品動(dòng)物源性成分鑒別的良好靶基因[11～13]。但以往所報(bào)道的研究中，所用動(dòng)物品種較少，而且針對(duì)線粒體DNA 16S rRNA基因的研究甚少。本項(xiàng)目擬選擇16S rRNA基因?yàn)榘谢?，根?jù)雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉、豬、牛、羊和兔等9種動(dòng)物16S rRNA基因的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)篩選雞特異性引物，并進(jìn)行系統(tǒng)性研究，擬建立基于線粒體DNA 16S rRNA基因的熒光PCR技術(shù)的畜禽肉中雞源性成分快速鑒別方法，為肉品真假識(shí)別提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、鴿肉和鵪鶉肉購自揚(yáng)州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，火腿腸和臘雞腿購自揚(yáng)州市大潤(rùn)發(fā)超市。

離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒，北京天根生化科技有限公司；2×PCR Mix，南京博爾迪公司；瓊脂糖，Promega公司；熒光染料預(yù)混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

將雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿和鵪鶉等 9種動(dòng)物肉樣攪碎至肉糜狀，以試劑盒法提取DNA，并溶于100 μL洗脫液中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)測(cè)定9種動(dòng)物DNA模板濃度均在110～210 ng/μL之間，其中雞為174.57 ng/μL?；鹜饶c、臘肉均通過優(yōu)化后的十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）方法[14]進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

以Genbank上公布的雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿、鵪鶉等動(dòng)物線粒體DNA 16S rRNA基因序列為靶基因，通過 Arraydesigner2.0、Oligo6.0、Bioedit等軟件比對(duì)分析，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成雞特異性引物，由上海生物工程公司合成，引物明細(xì)具體見表1。

表1 雞16S rRNA基因引物序列、Tm值及PCR產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence, Tm value and the size of PCR product

1.2.3 普通PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR 反應(yīng)體系為20 μL：其中2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L 正向和反向引物各 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，滅菌雙蒸水8.6 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；之后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后割膠回收、純化，并交由上海華大基因科技有限公司測(cè)序，采用雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上已知序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 熒光PCR擴(kuò)增

熒光PCR反應(yīng)體系為15 μL：其中Mix 7.5 μL，Dye 0.3 μL，1 μmol/L 正向和反向引物各 0.5 μL，DNA模板 1 μL，滅菌雙蒸水 5.2 μL。擴(kuò)增條件為：先是 50 ℃酶激活2 min；之后95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，觀察9種動(dòng)物DNA模板的擴(kuò)增曲線圖，并讀取循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值），判定引物的特異性。若無典型擴(kuò)增曲線且Ct值大于35，判定檢測(cè)體系無特異性擴(kuò)增。

1.2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將雞肉DNA模板濃度按10n倍梯度進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 101、102、103、104、105、106、107和108倍，觀察方法靈敏度，反應(yīng)條件同1.2.3和1.2.4。

1.2.6 樣品檢測(cè)

利用建立的方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 9種畜禽肉中雞源性成分常規(guī)PCR檢測(cè)

圖1 雞引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of chicken primer

圖2 雞肉DNA不同稀釋倍數(shù)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR product of different dilution ratio of chicken DNA

肉類作為人類重要的營(yíng)養(yǎng)來源，與人們生活和健康息息相關(guān)，研究肉類摻雜摻假以及畜禽肉動(dòng)物源性顯得尤為重要。PCR技術(shù)憑借其簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，在肉品來源等分析中已得到廣泛應(yīng)用，并取得良好效果[15]。本研究采用PCR技術(shù)，以設(shè)計(jì)篩選的基于雞線粒體DNA 16S rRNA基因的特異性引物，對(duì)雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿和鵪鶉等9種動(dòng)物DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)證明，該引物僅對(duì)雞肉DNA模板擴(kuò)增出特異性條帶，其它物種無擴(kuò)增（見圖1）。之后將雞肉DNA模板按10倍梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到 103倍即模板濃度為 174.57 pg/μL時(shí)，仍可見到特異性條帶（見圖2）。同時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的序列（GenBank登錄號(hào)分別為AB086102.1、GU261713.1、GU261678.1）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性均在99%以上，與預(yù)期結(jié)果一致，確定該條帶為雞肉成分。

2.2 9種畜禽肉中雞源性成分熒光PCR檢測(cè)

近年來，隨著對(duì)食品安全的日益重視以及分子生物學(xué)等技術(shù)的飛速發(fā)展，動(dòng)物源性成分各種檢測(cè)技術(shù)相繼涌現(xiàn)[16,17]，其中以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的技術(shù)在食品肉類成分鑒別與分析等方面日益成熟，尤其是熒光定量PCR技術(shù)，使得定量檢測(cè)成為可能，由于其具有簡(jiǎn)單快速以及靈敏度和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，已成為肉與肉制品中動(dòng)物源性成分鑒別普遍采用的方法之一[18,19]。齊春萌等[20]根據(jù)鴕鳥線粒體COⅠ基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了肉制品中鴕鳥源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法。許如蘇等[21]基于馬的種屬保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-LNA探針，建立了可快速檢測(cè)肉制品中馬源性成分的TaqMan-LNA熒光PCR檢測(cè)方法。

圖3 不同動(dòng)物熒光擴(kuò)增曲線圖Fig.3 Fluorescent Amplification curves of different animals

本研究以雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿和鵪鶉等9種不同動(dòng)物DNA為模板，以線粒體DNA 16S rRNA為靶基因，設(shè)計(jì)雞特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)篩選的雞引物僅雞肉DNA模板反應(yīng)后有典型擴(kuò)增曲線，Ct值為22.11，而其它動(dòng)物DNA模板反應(yīng)后無典型擴(kuò)增曲線且Ct值均大于35，具體見表2和圖3。目前，有關(guān)畜禽肉中雞源性成分檢測(cè)的研究報(bào)道甚少，而且已有的報(bào)道中涉及到的動(dòng)物種類偏少[22,23]。該方法的建立可以補(bǔ)充和完善我國(guó)畜禽肉與肉制品中摻雜、摻假檢測(cè)方法，保護(hù)肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

表2 不同動(dòng)物DNA模板熒光PCR擴(kuò)增Ct值Table 2 The Ct value of fluorescent PCR amplification of different animal DNA template

表3 雞DNA模板不同稀釋倍數(shù)獲得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of chicken DNA template

2.3 靈敏度檢測(cè)

圖4 DNA模板不同稀釋倍數(shù)擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curve of different dilution ratio

將雞肉DNA模板按10倍梯度稀釋，從DNA水平進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，確定方法檢測(cè)下限。

結(jié)果顯示，當(dāng)DNA模板稀釋倍數(shù)達(dá)到104倍，即DNA濃度為17.5 pg/μL時(shí)，Ct值為30.37，仍有典型擴(kuò)增曲線，可見該方法的靈敏度較高。具體結(jié)果見表3和圖4。

2.4 市場(chǎng)樣品隨機(jī)檢測(cè)結(jié)果

近年來，肉類摻假等食品安全事件屢屢發(fā)生，不法商家為了謀取利益，以次充好，以假亂真等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，本研究以建立的方法對(duì)從市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的樣品進(jìn)行雞源性成分檢測(cè)，以供監(jiān)管部門參考。結(jié)果顯示所抽檢的雞肉火腿腸和臘雞腿均檢測(cè)出了雞肉成分，而成分表明含有豬肉和牛肉的火腿腸未檢測(cè)出雞肉成分，具體見表4。

表4 隨機(jī)抽檢樣品雞源性成分檢測(cè)結(jié)果Table 4 The detection results of chicken origin ingredients in randomly sampling

3 結(jié)論

3.1 本研究根據(jù)雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿和鵪鶉等9種動(dòng)物線粒體DNA16S rRNA基因序列的位點(diǎn)差異，設(shè)計(jì)并篩選出了雞特異性引物，建立了基于熒光定量PCR檢測(cè)畜禽肉中雞源性成分的方法。

3.2 經(jīng)過多次試驗(yàn)和重復(fù)驗(yàn)證表明，所設(shè)計(jì)篩選的引物對(duì)只有在雞DNA模板存在的情況下才會(huì)發(fā)生特異性反應(yīng)，生成典型擴(kuò)增曲線，而對(duì)其它8種動(dòng)物肌肉DNA模板無典型擴(kuò)增曲線，可見該引物對(duì)特異性較好，該方法靈敏度較高，達(dá)到pg級(jí)，可以用于畜禽肉及肉制品中雞源性成分快速準(zhǔn)確地檢測(cè)，為肉品市場(chǎng)監(jiān)管提供依據(jù)。