夏君霞，李喜層，趙慧博，齊兵，王俊轉(zhuǎn)，路敏

（河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司，河北衡水 053000）

核桃，又稱胡桃，與榛子、扁桃和腰果并稱為世界四大著名干果[1]。核桃仁中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如多不飽和脂肪酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、多種維生素和微量元素等[2]，且核桃蛋白中氨基酸種類齊全，精氨酸和谷氨酸含量尤其高，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值[3]。

核桃乳是以核桃仁為原料，經(jīng)浸泡、堿液去皮、打漿、過濾、調(diào)配、均質(zhì)、殺菌和灌裝等步驟制成的[4]，其色澤乳白，香味濃郁，營(yíng)養(yǎng)豐富。但市場(chǎng)上銷售的核桃乳產(chǎn)品形式比較單一，生產(chǎn)工藝較為傳統(tǒng)，無法滿足消費(fèi)者多樣化的消費(fèi)需求。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)益生菌飲料的研究相當(dāng)火熱，益生菌能夠調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、改善乳糖不耐癥，并具有降低膽固醇吸收、延緩衰老、防治便秘和抑制腸道有害菌等眾多生理保健作用[5]。益生菌發(fā)酵核桃乳通過利用益生菌一方面具有核桃的多種保健功效，另一方面又含有一定量的功能性代謝產(chǎn)物，具有腸道保健功能，產(chǎn)品具有濃郁的核桃香味和發(fā)酵香味。且目前益生菌發(fā)酵純核桃乳尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，預(yù)期市場(chǎng)前景廣闊。

關(guān)于對(duì)發(fā)酵核桃乳的研究，許多學(xué)者在發(fā)酵基料中加入了牛奶、乳清粉等動(dòng)物蛋白以促進(jìn)益生菌發(fā)酵[6]，或直接以脫脂核桃粕為原料[7,8]，從本質(zhì)上來講不是純核桃發(fā)酵。而本文以核桃仁為原料，經(jīng)磨漿和均質(zhì)等工藝制成核桃乳，然后進(jìn)行滅菌、冷卻，向上述核桃基料中接種丹尼斯克復(fù)合益生菌進(jìn)行發(fā)酵，不需要額外添加牛奶，也不需要添加脫去核桃原料中的脂肪，從而制作成兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和酸甜口感的益生菌發(fā)酵純核桃乳。對(duì)發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行了摸索，并對(duì)發(fā)酵核桃乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 原料

復(fù)合益生菌，丹尼斯克（中國(guó)）投資有限公司；復(fù)配穩(wěn)定劑，丹尼斯克（中國(guó)）投資有限公司；核桃仁，河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司；蔗糖，廣西大新縣雷平永鑫糖業(yè)有限公司；葡萄糖，保齡寶生物股份有限公司；氫氧化鈉，天津坤鵬化工有限公司，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SG400型實(shí)驗(yàn)室乳化機(jī)，上海尚貴流體設(shè)備有限公司；JMS-80A膠體磨，廊坊市惠友機(jī)械有限公司；GYB60-6S高壓均質(zhì)機(jī)，上海市東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；恒溫加熱水浴槽、恒溫冷卻水浴槽，上海沃迪自動(dòng)化裝備股份有限公司；METTLER TOLED0型pH計(jì)，梅特勒一托利儀器有限公司；HENC實(shí)驗(yàn)室攪拌機(jī)-HW30，上海恒川機(jī)械設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD垂直凈化工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵核桃乳的制備工藝

1.3.2 發(fā)酵核桃乳產(chǎn)品品質(zhì)的確定方法

單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)均以發(fā)酵終點(diǎn)的可滴定酸度及冷藏后熟后產(chǎn)品的感官品質(zhì)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合確定產(chǎn)品品質(zhì)。具體如下：

1.3.2.1 可滴定酸度的測(cè)定

采用GB 5009.239-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定中規(guī)定的方法，具體操作如下：稱取10 g（精確到0.001 g）已混勻的試樣，置于150 mL錐形瓶中，加20 mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1000 mol/L）電位滴定至pH 8.3為終點(diǎn)；滴定過程中，向錐形瓶中吹氮?dú)?，防止溶液吸收空氣中的二氧化碳。記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)(V7)，同時(shí)用相應(yīng)體積的蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn)，讀取耗用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)(V0)試樣中的酸度數(shù)值以（oT）表示，按下式計(jì)算：

注：X7表示試樣的酸度，單位為度（oT）；c7表示氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；V7表示滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mL）；V0表示空白實(shí)驗(yàn)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升(mL)；100表示100 g試樣；m7表示試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；0.1表示酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。

1.3.2.2 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)[9]

選取 10名專業(yè)的、經(jīng)驗(yàn)豐富的食品感官評(píng)價(jià)人員，要求評(píng)定前2 d內(nèi)不許飲酒、抽煙以及吃任何刺激性食物，以免對(duì)品評(píng)結(jié)果造成影響。每對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行評(píng)定之后需立即用清水漱口，然后再進(jìn)行下一個(gè)產(chǎn)品的品評(píng)。評(píng)定人員分別對(duì)產(chǎn)品色澤與外觀、口感細(xì)膩度、口味及香氣、組織狀態(tài)4個(gè)因素進(jìn)行感官評(píng)定，總分為100分，其中顏色與外觀20分，口感細(xì)膩度20分，口味及香氣30分，組織狀態(tài)30分，根據(jù)四個(gè)因素的品評(píng)結(jié)果綜合進(jìn)行評(píng)價(jià)。成品的感官指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵核桃乳感官品質(zhì)評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation of fermented walnut milk beverages

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以碳源比例、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間為研究對(duì)象，以發(fā)酵終點(diǎn)的可滴定酸度和感官品質(zhì)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的單因素水平。

1.3.3.1 碳源比例的影響

在核桃乳原漿中，加入葡萄糖和蔗糖，比例分別為2:5、3:4、4:3、5:2，經(jīng)滅菌、冷卻，投入等量的直投式復(fù)合益生菌，在相同的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)相同時(shí)間，研究碳源比例對(duì)于發(fā)酵核桃乳品質(zhì)的影響。

1.3.3.2 發(fā)酵溫度的影響

確定漿液中葡萄糖：蔗糖的比例為 4:3，經(jīng)滅菌冷卻后，投入相同量的復(fù)合益生菌，分別設(shè)定發(fā)酵溫度為38 ℃、40 ℃、42 ℃和44 ℃，培養(yǎng)相同時(shí)間，研究發(fā)酵溫度對(duì)于發(fā)酵核桃乳品質(zhì)的影響。

1.3.3.3 接種量的影響

確定漿液中葡萄糖：蔗糖的比例為 4:3，經(jīng)滅菌冷卻后，設(shè)定0.035 g/L、0.045 g/L、0.055 g/L和0.065 g/L四個(gè)不同的接種量，于 42 ℃下恒溫培養(yǎng)相同時(shí)間，研究接種量對(duì)于發(fā)酵核桃乳品質(zhì)的影響。

1.3.3.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

確定漿液中葡萄糖：蔗糖的比例為 4:3，經(jīng)滅菌冷卻后，按0.055 g/L的接種量，在42 ℃下恒溫發(fā)酵，設(shè)定6 h、7 h、8 h和9 h四個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)于發(fā)酵核桃乳品質(zhì)的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交對(duì)發(fā)酵核桃乳的品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以確定最佳的發(fā)酵工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源比例對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖1 碳源比例對(duì)可滴定酸度的影響Fig.1 The effect of different adding amount of sucrose and glucose on acidity of the fermented walnut milk

圖2 碳源比例對(duì)感官品質(zhì)的影響Fig.2 The effect of different adding amount of sucrose and glucose on sensory quality of the fermented walnut milk

碳源比例對(duì)可滴定酸度和感官品質(zhì)的影響如圖 1和圖2所示，隨著葡萄糖:蔗糖的比例增大，可滴定酸度逐漸增加，而超過4:3后，增加的較緩慢。而且當(dāng)葡萄糖:蔗糖=4:3時(shí)，產(chǎn)品的組織狀態(tài)較好，無析水分層現(xiàn)象，無異味，感官評(píng)分最高。因此，確定最佳碳源比例為葡萄糖:蔗糖=4:3。

葡萄糖和蔗糖均能夠?yàn)橐嫔纳L(zhǎng)提供碳源。葡萄糖是單糖，能夠在發(fā)酵初期為益生菌的生長(zhǎng)繁殖提供優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)。而蔗糖是與蛋白質(zhì)親和性最高的糖類，能夠防止均質(zhì)處理后已微細(xì)化的蛋白質(zhì)分子聚沉，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性[10]?？梢妰烧吲浜鲜褂脤?duì)于發(fā)酵進(jìn)程及產(chǎn)品的品質(zhì)均產(chǎn)生有利作用。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)可滴定酸度的影響Fig.3 The effect of different fermentation temperature on acidity of the fermented walnut milk

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)感官品質(zhì)的影響Fig.4 The effect of different fermentation temperature on sensory quality of the fermented walnut milk

發(fā)酵溫度對(duì)可滴定酸度和感官品質(zhì)的影響如圖3、圖4所示，隨著發(fā)酵溫度的升高，可滴定酸度逐漸升高。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，益生菌大量繁殖，但發(fā)酵進(jìn)程緩慢，所需的發(fā)酵時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，增加了生產(chǎn)成本。而發(fā)酵溫度超過42 ℃時(shí)，益生菌代謝旺盛，產(chǎn)酸速度增快，但產(chǎn)品的風(fēng)味較差，且會(huì)出現(xiàn)分層、底部析水的現(xiàn)象。綜合考慮感官品質(zhì)，確定最佳發(fā)酵溫度為42 ℃。

2.1.3 接種量對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖5 接種量對(duì)可滴定酸度的影響Fig.5 The effect of different inoculation amount on acidity of the fermented walnut milk

圖6 接種量對(duì)感官品質(zhì)的影響Fig.6 The effect of different inoculation amount on sensory quality of the fermented walnut milk

接種量對(duì)可滴定酸度和感官品質(zhì)的影響如圖5和圖6所示，可以看出，接種量越大，發(fā)酵終點(diǎn)的可滴定酸度越高。當(dāng)接種量為0.035 g/L時(shí)，產(chǎn)酸速度較慢，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需的時(shí)間過長(zhǎng)。而當(dāng)接種量超過0.055 g/L后，產(chǎn)品的酸度過高，導(dǎo)致產(chǎn)品酸甜比失調(diào)，口感變差。因此，綜合考慮產(chǎn)品品質(zhì)，確定最佳接種量為0.055 g/L。

接種量的大小在一定范圍內(nèi)直接影響益生菌在核桃乳中的定殖，對(duì)產(chǎn)酸速度有較大影響。一般來講，接種量大對(duì)益生菌的定殖有利，產(chǎn)酸速度會(huì)越快。但產(chǎn)酸速度過快時(shí)，不利于產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的形成，會(huì)造成香氣變差甚至產(chǎn)生異味；且產(chǎn)生的酸性物質(zhì)過多時(shí)會(huì)抑制益生菌自身生長(zhǎng)、繁殖，反而對(duì)發(fā)酵不利[11]。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)可滴定酸度和感官品質(zhì)的影響如圖 7和圖8所示，6~8 h內(nèi)，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)品的可滴定酸度越高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過8 h，產(chǎn)酸慢慢趨于平衡，這是因?yàn)楫a(chǎn)生的有機(jī)酸和代謝產(chǎn)物會(huì)抑制益生菌自身的生長(zhǎng)代謝。但不是酸度越高，產(chǎn)品的品質(zhì)越好。

發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)品的組織狀態(tài)較差，且產(chǎn)品過酸，酸甜比失去平衡。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7 h時(shí)，產(chǎn)品的香氣較濃郁，酸甜適中，且在冷藏過程中后酸化能力較弱，感官品質(zhì)最佳。因此，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間為7 h。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可滴定酸度的影響Fig.7 The effect of different fermentation time on acidity of the fermented walnut milk

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官品質(zhì)的影響Fig.8 The effect of different fermentation time on sensory quality of the fermented walnut milk

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)因素水平表

選取碳源比例（葡萄糖:蔗糖）（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和培養(yǎng)時(shí)間（D）四個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，其中碳源比例的水平為葡萄糖:蔗糖=2:5、4:3、5:2，溫度水平為40 ℃、42 ℃、44 ℃，接種量為0.045 g/L、0.055 g/L、0.065 g/L，培養(yǎng)時(shí)間為6 h、7 h、8 h。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)的方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

從對(duì)發(fā)酵工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，不同的葡萄糖與蔗糖比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)益生菌發(fā)酵核桃乳的可滴定酸度和感官評(píng)分造成影響。

通過對(duì)可滴定酸度的極差分析可知（見表3），在影響酸度的4個(gè)因素中，主次順序?yàn)镃>A>B>D，即接種量的影響最大，碳源比例和發(fā)酵溫度次之，發(fā)酵時(shí)間的影響最小。最優(yōu)組合為A2B3C3D3，即在葡萄糖:蔗糖=4:3，發(fā)酵溫度44 ℃，接種量0.065 g/L，發(fā)酵時(shí)間8 h時(shí)，發(fā)酵核桃乳的可滴定酸度最高。通過對(duì)感官評(píng)分的極差分析可知，在影響感官評(píng)分的4個(gè)因素中，主次順序?yàn)镈>C>A>B，即發(fā)酵時(shí)間的影響最大，接種量和碳源比例次之，發(fā)酵溫度的影響最小。最優(yōu)組合為 A3B3C3D3，即在葡萄糖:蔗糖=5:2，發(fā)酵溫度44 ℃，接種量0.065 g/L，發(fā)酵時(shí)間8 h時(shí)，發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)分最高。

對(duì)上述兩個(gè)最優(yōu)組合做驗(yàn)證試驗(yàn)，優(yōu)化組1的測(cè)定結(jié)果為可滴定酸度為64.5 oT，感官評(píng)分為92；優(yōu)化組2的測(cè)定結(jié)果為62.5 oT，感官評(píng)分為95。由于酸度影響發(fā)酵核桃乳的感官品質(zhì)，所以在酸度的選擇上并非越高越好，而需綜合考慮其感官評(píng)分。比較兩個(gè)優(yōu)化組的感官評(píng)分，優(yōu)化組2高于優(yōu)化組1，并考慮生產(chǎn)實(shí)際等因素，確定最優(yōu)組合為A3B3C3D3，即葡萄糖:蔗糖=5:2，發(fā)酵溫度44 ℃，接種量0.065 g/L，發(fā)酵時(shí)間8 h。進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，產(chǎn)品的感官評(píng)分最高。

2.3 發(fā)酵前后主要理化指標(biāo)變化

2.3.1 檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)檢測(cè)采用GB 5009.5中的第一法，凱氏定氮法；脂肪檢測(cè)采用GB 5009.6第二法，酸水解法；碳水化合物檢測(cè)采用減量法，由 100%一蛋白質(zhì)的含量-脂肪含量-灰分-水含量所得。

氨基酸的檢測(cè)采用GB/T 5009.124-2003法，總氨基酸為所測(cè)得的各氨基酸之和；共軛亞油酸的檢測(cè)采用氣相色譜法。

2.3.2 檢測(cè)結(jié)果及分析

從表5可以看出，發(fā)酵后氨基酸總含量明顯增加，這是由于乳酸菌代謝活動(dòng)將蛋白質(zhì)水解生成為多肽，再將多肽轉(zhuǎn)化為游離氨基酸。

同時(shí)，8種必需氨基酸含量均有不同程度的增加，必須氨基酸是人體自身不能合成的，需要從食物中攝取。發(fā)酵后必須氨基酸含量增加，使得發(fā)酵后核桃乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提升。

表5 發(fā)酵前后總氨基酸及8種必需氨基酸百分含量變化Table 5 Changes of total amino acids and 8 essential amino acids contents of the walnut milk before and after fermentation

由表6數(shù)據(jù)可知，發(fā)酵前后蛋白質(zhì)和脂肪的總含量變化不顯著，碳水化合物的含量略有降低，發(fā)酵后活性物質(zhì)共扼亞油酸由無到有。共軛亞油酸（Conjuated Linoleic Acid，CLA），十八碳二烯酸，是亞油酸（Linoleic acid，LA）的一組構(gòu)象和位置異構(gòu)體。共扼亞油酸具有清除自由基，增強(qiáng)人體的抗氧化能力和免疫能力，防止動(dòng)脈粥樣硬化等作用。許多學(xué)者[12,13]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過發(fā)酵利用亞油酸產(chǎn)生CLA。這主要是由于乳酸菌細(xì)胞含有亞油酸異構(gòu)酶，其作用位點(diǎn)是脂肪酸的C-12雙鍵，而不是C-9雙鍵，它能把亞油酸轉(zhuǎn)化為c9, t11-CLA。而核桃本身亞油酸含量豐富，為形成 CLA提供了豐富的底物基礎(chǔ)，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后核桃乳中亞油酸部分轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA。

表6 發(fā)酵前后理化指標(biāo)及共軛亞油酸變化Table 6 Changes of Physical and chemical indexes and conjugated linoleic acid

3 結(jié)論

3.1 本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化確定了益生菌發(fā)酵純核桃乳的最優(yōu)發(fā)酵工藝，結(jié)果表明：在葡萄糖:蔗糖=5:2，發(fā)酵溫度44 ℃，接種量0.065 g/L，發(fā)酵時(shí)間8 h的條件下制得的益生菌核桃乳成品酸甜可口、狀態(tài)均一穩(wěn)定。此工藝為發(fā)酵核桃乳的工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

3.2 核桃乳經(jīng)益生菌發(fā)酵后，蛋白質(zhì)和脂肪的總含量變化不顯著，碳水化合物的含量略有降低，氨基酸總含量明顯增加，8種必需氨基酸含量均有不同程度的增加，并產(chǎn)生了功能活性物質(zhì)共扼亞油酸，更有利于人體健康。