喬宏萍，裴梓汝，賀 超，李 闖，許 嘉，張玉榮，崔劍越，王 青

(太原師范學院 生物系，山西 晉中 030619)

水是生命之源，近些年水體污染越來越嚴重，而重金屬積累已成為水污染的重要因素之一.隨著礦產、電子、造紙、食品等各種工業(yè)的發(fā)展，大量的重金屬及其化合物隨著污水被排放到環(huán)境中，造成水資源污染，進而影響動植物，甚至人類身體健康.傳統(tǒng)的重金屬治理法——物理和化學法，因耗費高，易造成二次污染，而逐漸被生物吸附法所代替.微生物吸附逐漸成為生物吸附重金屬污染的重要發(fā)展方向，主要是通過微生物(酵母、細菌和藻類等)吸附，在微生物體內對重金屬的化學形態(tài)進行轉變，從而降低毒性.生物吸附法作為成本較低，效率高，對環(huán)境影響小的技術，越來越受到各國研究人員的重視[1].本實驗室從污水處理廠的污泥中分離篩選出高度耐受重金屬鎘的細菌BCD1，對其進行形態(tài)學，生理生化以及分子生物學的鑒定并進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，為進一步研究其吸附機理，將其應用于處理富含重金屬的污水奠定一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 菌株：細菌BCD1.

1.2 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，定容至1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌20 min.

1.3 BCD1的形態(tài)學鑒定：觀察菌株在牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基菌落的形態(tài)、顏色、大小以及美蘭染色后在油鏡下觀察細菌孢子的形態(tài)和大小.

1.4 生理生化指標的測定

根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》測定了細菌生長常見的幾種常見的生理生化指標，如需氧性和運動性、生長溫度(15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃)、耐鹽性、淀粉溶解、pH=5.7培養(yǎng)基中生長狀況、纖維素分解和明膠液化等.

1.5 分子生物學鑒定

細菌DNA分子的提取采用康為世紀公司試劑盒提取，采用細菌16SrRNA通用引物(SF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SR：5’-AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3’)進行PCR擴增.PCR反應體系為：模板DNA 0.2 μM，上下游引物各0.4 μM，2×Taq Master Mix25 μl，加雙蒸水補充至50 μl.反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸2 min，共30個循環(huán).所得擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠板，在120 V，60 mA條件下進行電泳檢測.

圖1 BCD1菌株的細胞形態(tài)圖 10×100倍光學顯微鏡

1.6 序列測定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

經(jīng)由PCR擴增純化后得到的16SrRNA，送上海生工基因公司進行測序.對所得序列提交GenBank比對，進行同源性比較，下載9條同源性較高的細菌16SrRNA序列，進行聚類分析，所采用軟件為ClustalX(windows-xp-2.0)，并通過MEGA6進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建.

2 結果與分析

2.1 BCD1的形態(tài)學觀察

將活化后的菌株BCD1經(jīng)革蘭氏染色為陰性，接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，菌落近圓形凸起，淡黃色，邊緣整齊，經(jīng)美蘭簡單染色后，在油鏡下觀察如圖1細胞呈短桿菌，1.0～5.0 μm，單個存在.

2.2 生理生化指標的測定

從表1可以看到，菌株BCD1好氧；最低生長溫度為15 ℃，最適宜的生長溫度為25 ℃～30 ℃，42 ℃幾乎不生長；在pH為5.7的培養(yǎng)基中可以生長，具有一定的耐鹽性，可以在7%的NaCl培養(yǎng)基中生長，但在10%的NaCl培養(yǎng)基中不能生長；水解淀粉周圍變色，為陰性反應；不能分解纖維素和明膠，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖等.

根據(jù)1994年伯杰細菌鑒定手冊描述：假單胞菌為卵圓形，常單個存在，以極生的多鞭毛運動，對明膠淀粉不水解，專性好氧，可以分解利用葡萄糖果糖等，生長最適溫度約25 ℃～30 ℃，41 ℃不生長.從BCD1的培養(yǎng)特征、形態(tài)學以及生理生化結果與假單胞菌的菌株非常相似，還需要進一步進行分子生物學鑒定.

表1 生理生化指標的測定

2.3 分子生物學鑒定

將細菌BCD1提取總DNA后，進行PCR擴增得到大約1 500 bp左右的產物，經(jīng)純化后送上海生工基因公司測序后，得到1 066 bp的序列.經(jīng)過Blast比對后與惡臭假單胞菌Pseudomonasputida相似性為100%.通過Sequin提交GenBank后，獲得登陸號KY321933.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖2 BCD1菌株的16SrRNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹的構建采用clustalX和MEGA6.06_setup軟件進行.登陸www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站，下載了9條常見細菌種類的16SrRNA序列：惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaKC422697)、熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensKC495571)、大腸桿菌(Escherichia.coliJ01859)、炭疽桿菌(BacillusanthracisX55059)、克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaeJQ003560)、耶爾森菌(YersiniapestisL37604)、霍亂弧菌(Vibrio.choleraeX74694)氣單胞菌屬(Aeromonas.sp JX839764)和檸檬酸桿菌屬(Citrobactersp HE575919).使用NJ法建樹后，發(fā)現(xiàn)BCD1菌株與惡臭假單胞菌(PseudomonasputidastrainKC422697)聚在一起.

綜上所述，通過形態(tài)學、生理生化特性和分子生物學鑒定結果，可以初步確定BCD1為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida).

3 結論與討論

耐重金屬細菌BCD1無論在形態(tài)學，生理生化特性都與假單胞菌屬的特征非常相似，通過分子生物學鑒定后比對發(fā)現(xiàn)與惡臭假單胞菌的相似性可以達到100%，聚類分析二者也聚在一個分支，從而可以確定BCD1為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida).

近年來吸附重金屬的細菌報道[1-7]的主要有假單胞屬(Pseudomonas.sp)、芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)、檸檬酸菌屬(Citrobacter.sp)、大腸桿菌屬(E.coli)以及鏈霉菌屬(Streptomyces.sp)等，它們可以通過產生多糖、蛋白等物質吸附重金屬離子，也可以將重金屬離子與熱蛋白等結合轉化為無毒性或低毒性的離子，或者微生物可以產生氧化還原酶，催化金屬離子進行氧化還原反應從而改變其性質等.不同的微生物具有不同的吸附功能，本試驗獲得的吸附鎘的細菌BCD1通過鑒定后屬于假單胞屬，在后續(xù)的機理和應用研究中可以根據(jù)菌種的特性進行.