許 雪， 陳 曦， 趙佳敏， 張自力， 李永猛

(河北工業(yè)大學人工智能與數(shù)據(jù)科學學院，天津 300130)

0 引 言

隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，臨床血型即時檢測工作日益繁重。匹配錯誤會導致嚴重后果，因此必須保證獻血與輸血間血型的一致性。微柱凝膠檢測法[1]是目前國際衛(wèi)生組織特別推薦的方法，較之傳統(tǒng)玻片法、試管法，其靈敏度可提高10倍以上，結果穩(wěn)定便于檢測。微流控芯片技術具備微量、高通等特點，可實現(xiàn)在微升級別上的集成分析以及各項操作與功能[2]，檢測過程易實現(xiàn)自動化、批量化、高效化、精度化，被廣泛用于醫(yī)學檢測、基因分析、細胞篩選等眾多領域[3-4]。為提高檢測精度，對使用的微流控芯片具有較高的要求。然而，微流裝置的微細加工需要昂貴的實驗室設備，雖然存在相對便宜的制造技術，如聚合物基（PDMS）微細加工，其利用模具的光刻制造來制備芯片，微流通道開放，并需要熟練的專業(yè)人員。此外，紙基微流控芯片或試紙對環(huán)境條件敏感，且需要實驗室條件進行批量生產(chǎn)，耗時耗力。而一臺3D打印機，可將多步驟集成到一個按鈕中，能達到快速制備一張密閉高通流道微流控芯片的目的，通道更安全、可靠。同時，微流控芯片需要相對精確的3D打印，而現(xiàn)有大部分3D打印機中，F(xiàn)DM（熔融沉積型）精度不夠，SLA（光固化）精度達到，但價格較高。液晶掩模（LCD masking），能即時打印，但缺點是LCD屏易損易老化，可選范圍少，成本相對較高。因此，本文采用目前流行的一種基于面投影，逐層光固化的高精度數(shù)字光處理（digital light processing，DLP）3D打印技術，采用微升級工藝進行微流控芯片的制備。較傳統(tǒng)制備方法，速度更快，通道精度更高；通道密閉，安全性能更好，同時相對于LCD成本更低，選擇范圍更廣，能滿足對血型的快速即時檢測要求。

3D打印技術制造方法便捷，同時擁有較高精度，已有很多研究將其應用于微流控芯片的加工中[5]。如Spivey等[6]使用基于DLP技術的3D打印機加工了用于研究細胞衰老的微流控芯片，精度可達4 μm。然而，3D打印與醫(yī)學診斷芯片相結合的應用還沒有得到很好地探索，尤其對于微升級3D打印微流控芯片的制備，在速度和精度方面還有待發(fā)展。因此，設計研究一種密閉微通道的用于血型檢測的3D微流控芯片很有必要。

1 方 法

1.1 DLP（數(shù)字光處理）3D打印技術

數(shù)字微鏡裝置的數(shù)字光處理（DLP）3D打印技術，較傳統(tǒng)的微立體光刻技術，打印速度和準確度進一步提高[5]。DLP工作原理，如圖1所示，在3D打印過程中，激光照射到一個由MEMS技術加工而成的微鏡陣列上，通過微鏡陣列對激光反射的控制（陣列角度±10°）達到選擇性曝光光刻膠的目的，通過面成型代替點成型，光強分布均勻，穩(wěn)定性強，同時可以達到工業(yè)級精度，大幅度減少打印時間，提高效率。

圖1 DLP 3D打印技術工作原理

在3D打印微流控芯片過程中，激光對光敏樹脂進行曝光固化的同時，調(diào)節(jié)升降臺高度，采用下投影式，可動態(tài)地創(chuàng)造出每一層的光學圖案，逐層打印，如圖2所示，進而實現(xiàn)對整個3D微流控芯片的制備加工。

圖2 3D打印下投影式成型機原理圖

1.2 芯片的設計與制作

本文設計的血型檢測微流控芯片，使用桌面級3D打印機，直接將三維設計軟件AutoCAD的數(shù)字模型（輸出為stl格式文件），通過計算機轉換為特定厚度的截面數(shù)據(jù)，導入打印機，如圖3所示。實現(xiàn)芯片的制備，降低了人為因素誤差，更安全可靠。

圖3 微流控芯片打印流程圖

制備的微流控血型檢測芯片如圖4所示，尺寸為34 mm×33 mm×4 mm（長×寬×高）。

圖4 血型檢測微流控芯片概念圖及實物圖

1.2.1 芯片微通道反應腔結構

芯片的主要部分即微流道反應腔，該3D微流控芯片由6個規(guī)格相同的密閉微流通道反應腔（簡稱微流道）構成，分別為抗A、抗B、抗Rh（D）、對照A、B、D。該微流道灌裝容積約為9 μL，要求灌入到血型卡每個微柱內(nèi)藥液均為7 μL。流道總長16 mm，從采樣通道端口到入口儲液池呈階梯狀，長度分別為4 mm，7 mm，5 mm，寬度分別為0.5 mm，1 mm，1.5 mm，深度分別為0.3 mm，0.5 mm，0.7 mm，每個單通道平面構型設計如圖5所示，包括入口儲液池、試劑反應腔、采樣通道3個主要模塊[7]，芯片微流道結構設計三維示意圖見圖6。

圖5 芯片單通道平面構型圖

1.2.2 微流控芯片的制備

本文使用DLP的3D打印機（閃鑄Hunter），通過直接將AutoCAD數(shù)字設計導入打印機，創(chuàng)建單個血型檢測微流控芯片，從而實現(xiàn)概念到芯片的制造。該項目所需材料還包括3D打印的耗材透明樹脂，氫氧化鉀（KOH），乙二醇，過氧化氫。打印完成后，用異丙醇清洗3D芯片，并用空氣壓縮機沖洗未固化的樹脂[8]。為了增大芯片材料的親水性[9]，進一步提高微通道質(zhì)量，用0.1 mol/L KOH溶液活化樹脂，再將3D打印的微流控芯片浸入含有1.82 mol/L KOH的純乙二醇溶液中，在60℃下孵育2 h[9]，最后用水沖洗芯片，得到最終用于血型檢測的微流控芯片。

圖6 芯片微流道結構示意圖（單位：mm）

1.3 微流控芯片檢測識別

1.3.1 檢測原理

基于微柱凝膠技術，采用正定型的方法進行檢測，通過一次工序，在芯片入口儲液池灌入體積比為3:2的葡聚糖凝膠與抗體的膠液混合物，其凝膠介質(zhì)在50倍顯微鏡下如圖7所示。

圖7 凝膠型介質(zhì)顯微示意圖

加入樣本血液（每微通道約1 μL），采用離心機進行高速離心2 min。通過圖像識別微流管道內(nèi)紅細胞凝集停留位置（如圖8所示）：抗原抗體發(fā)生凝集時，凝集的紅細胞停留在分離介質(zhì)上層（+），為陽性反應；未發(fā)生凝集反應的，所有紅細胞通過分離介質(zhì)間隙，在微流道底部聚集（-），為陰性反應。最終，得到需要檢測的對應血型。

圖8 微流道凝膠抗體與紅細胞抗原示意圖

1.3.2 檢測流程

采用實驗室攝像機（型號：MV-EM200C，S/N：00464658），對微流控芯片進行拍攝。圖9（a）、圖9（c）為以LED為背光，紅色光源攝像頭照射下的芯片通道實物圖。

將采集到的原始六通道圖像進行剪裁，得到芯片單通道圖像，對圖像進行灰度化、噪聲濾波，并進行二值化處理得到二值圖，再通過Sobel算法[10]進行邊緣處理（見圖9（b）），拾取反應區(qū)形狀特征，采用質(zhì)心法得到質(zhì)心標記圖（如圖10所示），以便更好地對血型檢測結果進行自動識別。最后，通過識別二維碼對微流控芯片進行記錄，具體步驟如圖11所示。

2 結果與分析

3D打印質(zhì)量通過微觀結構的掃描電子顯微鏡（SEM）成像來表征[7]，圖9（d）為3D打印的微流控芯片微通道SEM圖，顯示打印圖層細節(jié)（400 μm）。通過測試，血型檢測微流控芯片滿足實驗要求。

2.1 芯片灌裝高度

采用微柱凝膠血型檢測法，對芯片微流道中試劑體積有嚴格要求，試劑過多或過少都會影響檢測結果。因此灌裝后需檢測芯片的膠液混合相高度是否符合標準。

圖10 質(zhì)心標記圖

圖11 血型檢測處理流程圖

在已有數(shù)據(jù)中，選擇了400張灌裝后芯片進行高度測量。表1是部分芯片膠液混相高度數(shù)據(jù)。其中N為芯片序號，1-i為第1張卡的第i個（1≤i≤6）微柱管；M1為手工測量的膠液混相高度；P1為Sobel算法檢測得到的膠液混相高度；誤差E1=P1-M1；t為單張微流控芯片六微柱管高測量總耗時。

對2 000張所有采集的膠液混相高度誤差數(shù)據(jù)作誤差數(shù)據(jù)直方圖并擬合分布曲線進行分析，如圖12所示，由圖像曲線可看出其分布近似于正態(tài)分布。

所以誤差概率密度函數(shù)可表示為

式中 μ為均值， σ為標準差。近似計算可得，μ=?0.0401，σ=0.0401。由 3σ原則知，數(shù)值分布在(μ?3σ,μ+3σ)中的概率為0.997 4，超出這個范圍的可能性不大于0.003，因此可以近似認為膠液高度誤差在（–0.160 4，0.080 2）區(qū)間內(nèi)，符合膠液高度測量的精度要求。即3D打印的微流控芯片，通道打印均勻，質(zhì)量符合精度要求。

表1 血型檢測微流控芯片微柱高度測量數(shù)據(jù)

圖12 膠液混相高度誤差分布（n=2 000）

2.2 芯片血型識別

在微流控芯片中灌入7 μL葡聚糖凝膠與抗體膠液混合試劑，進行獨立重復血型檢測實驗[11]。人工手動識別作為對照實驗記為A，微流控芯片圖像識別記為B，實驗樣本分別取A組（1 182片）、B組（1 409片）。其中，人工識別采用傳統(tǒng)方法進行滴定識別，而微流控芯片的血型檢測，通過圖像處理進行識別，血型檢測識別結果見表2。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果顯示，微流控芯片圖像識別，可在1 200 ms左右完成單樣品圖像檢測，單張整體耗時3 min左右，較臨床實際需求的5～20 min耗時較短，且樣品識別率提高至99.29%。

表2 微流控芯片血型檢測樣本識別

3 結束語

本文采用基于DLP的光固化3D工藝技術，設計制備了一種用于快速檢測血型的微流控芯片，利用該微流控芯片，對人體血液進行采樣檢測實驗，并對血型檢測結果進行分析。結果表明該芯片成功檢測出樣品血型種類，且檢測成功率較高，整個過程耗時較短，具有易于操作、成本低、試劑消耗少、快速即時檢測等特點。結合二維碼等智能手段，為個性化智慧醫(yī)院[12]的建立提供新的檢測基礎。本文對芯片的3D打印方法具有通用性，對打印復雜幾何結構的微流控芯片，均具有適用性。