李 娜，余群力，李紅波，閆向民，張金山，袁理星，杜 瑋，崔繁榮，葉治兵，張 楊*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730000；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000)

RNA提取技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)中一種常用技術(shù)，也是做好功能基因組學(xué)技術(shù)的第一步。其產(chǎn)量、純度決定了分子克隆和基因表達等研究數(shù)據(jù)的可靠性[1]。提取總RNA對Northern印跡及雜交分析以及主要由脂肪組織分泌合成的基因表達情況的試驗是至關(guān)重要的。到目前為止，已有大量利用各種和商業(yè)化試劑成功提出高質(zhì)量RNA的文獻[1]。由于組織特異性，某些特殊組織中總RNA的豐度極低(如脂肪，腦、骨骼肌等)，按照常規(guī)或是試劑說明書的通用步驟不能得到高質(zhì)量的RNA。在做基因RT-PCR定性分析過程中，很難進行反轉(zhuǎn)錄，進而阻礙研究的進展。因此本文以脂肪組織為材料，經(jīng)反復(fù)試驗，在試劑公司提供的RNA提取操作步驟基礎(chǔ)上進行優(yōu)化和改進。得到符合試驗要求高質(zhì)量的RNA。并利用改進后方法提取肉牛肌間、皮下、腎周和心周脂肪各組織中總RNA，進行了瘦素基因(Lep)在以上四個部位脂肪組織中的表達差異性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

參照張寧的方法進行采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/樣品立即投入液氮速凍，貼好標(biāo)簽、保存液氮中。

1.2 主要儀器、試劑及PCR引物

1.2.1 主要儀器及試劑 Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀；紫外分光光度計；TRIzol? Total RNA Reagent 總RNA提取試劑。

1.2.2 PCR引物 Gapdh內(nèi)參對照上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC3，，下游引物：5＇AGACACCGTGAAAAGGAGA 3＇產(chǎn)物長度163 bp；牛Lep基因上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC 3，，下游引物：5，CACTGAATGTTTGTGGAATG 3＇產(chǎn)物長度207 bp；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 總RNA的提取

按照TRIzol試劑說明書進行脂肪組織總RNA的提取，由于肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪等脂肪組織含有大量的油脂，而且RNA的豐度極低，所得含量極少。因此，特別對試驗部分操作步驟做了相應(yīng)的優(yōu)化與改進，希望從中獲得較高質(zhì)量的總RNA。TRIzol試劑說明書操作步驟優(yōu)化與改進關(guān)鍵點如下圖所示：

其TRIzol試劑說明書操作步驟優(yōu)化與改進關(guān)鍵點

(1)加大樣品量，在離心管中加入少許液氮，依次加入樣品充分混勻，延長靜置時間，使細(xì)胞完全裂解；

(2)萃取時將粘在離心管的脂肪取出，取得的下層溶液需做同樣的二次離心，以保證完全去除脂類污染。將兩個平行樣吸取上層水相，都置同一個新的離心管中解決提取過程中RNA濃度低的問題；

(3)沉淀RNA時，輕搖混勻、冰上放置、縮短靜止時間減少降低RNA降解；

(4)洗滌去除DNA時，75%的乙醇必須用特制水配制可抑制RNA酶，延長RNA保存時間，此步驟重復(fù)一次可有效除去基因組DNA污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪組織總RNA瓊脂糖電泳

為進一步檢測所提取總RNA的質(zhì)量，用1%甲醛變性膠電泳檢測，120V，15 min，UV凝膠成像儀下照相(圖1、2、3)。

圖1 按說明書所提肌肉中的RNA的電泳結(jié)果 圖2 按說明書所提的脂肪中RNA的電泳結(jié)果

由圖1可知，按照TRIzol說明書操作方法提取肌肉中的RNA條帶比較清晰，說明完整性好，得率高。但是圖2中按照說明書操作方法提取脂肪組織中的RNA有基因組DNA污染，28S與18S的rRNA帶不清楚得到的RNA純度及濃度無法進行后續(xù)試驗。由圖3可知經(jīng)過對操作方法改進后，脂肪組織中RNA制品沒有受到基因組DNA污染，條帶比較清晰，28S和18S的rRNA亮度比值約為2/1，表明RNA制品純度高且完整性好產(chǎn)量高。

圖3 TRIzol操作方法改進后所提的RNA的電泳結(jié)果

2.2 操作方法改進前后RNA的純度和得率比較

用紫外分光光度計分別檢測脂肪及肌肉樣品中提取的RNA 純度及得率，用Graphpad prism統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1：

表1 提RNA操作方法改進前后的純度和得率比較

注：同列數(shù)據(jù)進行比較，不同大寫字母的表示差異極顯著P<0.01。

由表1可知，改進后脂肪組織中的RNA與未改進肌肉組織中的RNA的純度差異不顯著，但得率差極顯著(P<0.01)，與未改進脂肪組織中的RNA的純度、得率差異極顯著(P<0.01)。

2.3 試驗成本比較分析

RNA提取已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)一項很成熟的技術(shù)，但由于RNase酶非常穩(wěn)定不易滅活，很難在實際研究中獲得高質(zhì)量的RNA[2-3]。目前，成本價為1600元/100次的TRIzol試劑可提取各種組織中RNA，經(jīng)對部分步驟進行改進和優(yōu)化后，可提取RNA含量少的脂肪組織中的RNA，其提取的RNA純度和濃度完全可以滿足后續(xù)試驗的要求，與成本價約為3 000～5 000元/100次脂肪組織總RNA的試劑盒相比，體現(xiàn)成本低廉，并能取得理想的試驗效果。

綜上所述，通過TRIzol方法部分步驟改進和優(yōu)化后，試驗結(jié)果得到了符合后續(xù)試驗要求的高質(zhì)量RNA，同時該方法所用試劑價格低廉，完全可以替代價格昂貴的試劑盒進行脂肪組織中總RNA的提取。因此，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇適合試驗條件和要求的運用此方法。

2.4 開展Lep基因的在不同脂肪組織中的表達差異

在伊犁西天山農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司隨機選取舍飼條件下、年齡、營養(yǎng)條件均一致的成年新疆褐牛公牛20頭，屠宰后并采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)立即投入液氮速凍，貼好標(biāo)簽、保存液氮中開展Lep基因在不同脂肪組織中表達差異的研究。

按照改進后的方法，分別從肌間、皮下、腎周、心周脂肪組織中提取并純化獲得高質(zhì)量的RNA，以Lep、Gapdh為引物進行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。本試驗以肌間脂肪為參照，采用Graphpad prism統(tǒng)計軟件對不同部位Lep基因表達差異性進行研究。反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如圖4、表2。

經(jīng)統(tǒng)計結(jié)果表明，Lep基因在新疆褐牛不同部位脂肪組織中的表達量是不同的。Lep在肌間脂肪組織表達量極顯著高于腎周、皮下脂肪組織(P<0.01)如：表2、圖5。

M：D2000 marker；1、2、3、4、6：RT-PCR產(chǎn)物

表2 Lep基因在不同脂肪組織的表達水平

以肌間為對照同行數(shù)據(jù)間進行單因子方差分析， *表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著。

圖5 Lep基因在不同脂肪組織中的表達水平

3 討論

成年動物的脂肪組織單位體積細(xì)胞數(shù)量與其他組織相比較少，脂質(zhì)含量豐富[4-5]，因而每毫克組織樣品所含總RNA的量小于0.05μg，若增加組織塊的量，造成總RNA得率較低。當(dāng)RNA的量很少時，不僅造成電泳時極有可能看不見條帶，就不知道其是否完整，也就不能通過觀測RNA的完整性來推測mRNA是否降解。而且使RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA的濃度低，熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。按照試劑公司說明書提取脂肪組織中RNA效果不理想。本研究以脂肪組織為材料，在總RNA提取試劑盒說明書操作步驟基礎(chǔ)上，優(yōu)化和改進提取過程中的一些步驟，對脂肪組織進行提取前處理、縮短了RNA沉淀時間，有效除脂，改變了靜止方式有效的減少RNA降解。得到了符合試驗要求的高質(zhì)量、高純度的總RNA。不僅能用于脂肪組織，也可以用于RNA得率較低的組織如：心臟、骨骼肌等纖維組織或腦等富含脂肪較多的組織。

Lep在成熟的脂肪細(xì)胞中，可以直接促進甘油三酯的分解，降低脂肪合成[6-8]。利用改進后的RNA提取方法，成功的提取新疆褐牛肌間、皮下、腎周、心周脂肪組織中高質(zhì)量RNA，經(jīng)相對定量PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Lep在四個部位都有表達，但在肌間脂肪組織表達量極顯著高于在其他脂肪組織中的表達水平，表明Lep基因表達具有組織特異性。

4 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化和改進提取步驟，對RNA含量少的脂肪組織有效除脂，減少了RNA降解，降低提取成本，得到了符合試驗要求的高質(zhì)量的RNA。在后續(xù)新疆褐牛脂代謝調(diào)控Lep基因在不同部位脂肪組織中表達試驗中得到了可靠的數(shù)據(jù)。為今后RNA定量或定性試驗以及新疆褐牛肉用新類型選育提供技術(shù)支撐。