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(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院， 四川 自貢 643000； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所， 貴陽 550008)

作為第二信使的Ca2+,其濃度在植物細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格的控制。正常處于靜息態(tài)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度處于極低的水平，受到逆境脅迫如鹽脅迫、干旱脅迫和病菌感染時(shí)鈣離子濃度開始上升，之后又恢復(fù)至低水平。鈣離子通道存在于細(xì)胞的不同部位，包括細(xì)胞膜、線粒體膜、高爾基體、液泡膜、葉綠體膜和細(xì)胞核上[1]。鈣離子通道很多，可能參與不止一條植物的生理途徑，即使是參與同一個(gè)途徑，作用與調(diào)控機(jī)制也可能不相同。研究表明，鈣離子通道參與高鹽、防御干旱等逆境脅迫和抗細(xì)菌感染，但對于單個(gè)鈣離子的運(yùn)輸通道研究并不全面[2]。研究單個(gè)鈣離子通道與植物抗逆的關(guān)系對了解Ca2+在不同時(shí)空上的特異性調(diào)控是非常有意義的，比如擾亂擬南芥液泡Ca2+的ATP酶誘導(dǎo)了SA介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[3]。而CAXs家族與ACAs(Ca2+-ATPase)同樣能將胞質(zhì)內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞器內(nèi)或細(xì)胞外，從而降低胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的濃度，與ACAs家族成員相比，CAX 1對Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)但是親和力弱[4]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Ca2+/H+Cation Exchanger 1，CAX 1)，定位于液泡膜，利用H+濃度梯度產(chǎn)生ATP把Ca2+泵入液泡膜內(nèi)，H+泵入細(xì)胞質(zhì)，從而去除細(xì)胞質(zhì)中多余的Ca2+[5]。根據(jù)研究表明，CAX 1對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度平衡，控制植物正常的生長發(fā)育[6]，以及調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的抗逆如鹽脅迫和低溫脅迫至關(guān)重要[7-8]。CAX 1能調(diào)節(jié)擬南芥葉片氣孔的大小而影響氣體交換，改變不同離子組分的平衡[9]，通過改變原質(zhì)體pH變化調(diào)節(jié)生長素的吸收。該基因包含1 428個(gè)堿基和475個(gè)氨基酸。該課題通過利用 PCR技術(shù)從擬南芥植物中的cDNA擴(kuò)增出基因CAX1與pMD 18-T載體連接得到重組質(zhì)粒，再連接在一種常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化雙元質(zhì)粒pBI 121質(zhì)粒的 CaMV 35 S啟動子和 NOS終止子之間[10],并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和酶切鑒定，以期為研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX 1構(gòu)建過量表達(dá)株系是否影響植物抗病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

擬南芥哥倫比亞野生型Col-0幼嫩葉片。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒

受體菌大腸桿菌DH 5 α，pBI 121質(zhì)粒和pMD 18-T載體由四川理工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和試劑盒

PCR相關(guān)試劑，限制性內(nèi)切酶,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 2000)和cDNA第一鏈合成試劑盒購于大連寶生物Takara公司；快速質(zhì)粒小提取試劑盒和RNA提取試劑Trizon購于康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖和抗生素卡那購自sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥RNA提取和cDNA的合成

于液氮中收取4周左右的擬南芥嫩葉50 mg，并在液氮中迅速充分研磨成粉末，加入1 mL Trizon提取液，反復(fù)吹打混勻；室溫放置5 min，加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩后放置3 min，低溫離心15 min,將上清取至一新的RNase-Free EP管中，加入等體積異丙醇，混勻,放置10 min,離心棄上清，再用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，離心去上清，室溫晾干,加入40μL無RNase的水溶解RNA。并且電泳檢測RNA質(zhì)量。然后取1μg RNA按照Takara公司試劑盒說明書以O(shè)ligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：

混合體系的成分反應(yīng)體積5×RT-Buffer4μLdNTP Mixture(每10mM)2μLSuper-RI0.5μLRT-Enhancer0.5μLOligo (dT) primer(0.5μg/μL)1μLReverstranscriptase1μLRNA2μLRNase Free dH2O9μL

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序： 42 ℃，40 min，99 ℃，5 min，保存在4 ℃。

1.2.2 引物和擴(kuò)增CAX 1基因

CAX1基因序列號為AT 2 G 38170，開放閱讀框序列在TAIR(http://www.arabidopsis.org/)上查得CDS序列，并根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物:F 1:5’ATGGCGGGAATCGTGACA 3’；R 1:5’ACCCGTTTTAACTTTATTTGATG 3’；以合成的第一鏈cDNA為模板，配制20μL PCR擴(kuò)增體系后進(jìn)行電泳檢測。再參照T載體的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出在基因兩端增添酶切位點(diǎn)的長引物：TM:59.8，F(xiàn) 2:5’TGCT↓CTAGAATGGCGGGAATCGTGACA 3’含XbaI酶切位點(diǎn)；R 2:5’CG↓AGCTCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAACCCGTTTTAACTTTATTTGATG 3’含SacI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增體系電泳檢測后得到正確片段后進(jìn)行膠回收。

反應(yīng)體系(20 μL)：

反應(yīng)體系反應(yīng)體積模版cDNA2μLR21μLF21μLddH2O12.3μL10×buffer(Mg2+)2μLdNTP1.5μLTaq酶0.2μL

PCR程序：

95 ℃ 3 min

72 ℃ 10 min

8 ℃ 1 h

(起始密碼子和終止密碼子用黑體表示，1 428個(gè)堿基)圖3 CAX 1基因的核苷酸序列

1.2.3 CAX 1的克隆和基因測序

配制連接體系(10μL):經(jīng)過PCR擴(kuò)增后并回收的CAX1片段1.5μL，pMD 18-T載體1μL，ddH2O 2.5μL，連接buffer 5μL；置于16 ℃恒溫水浴鍋中連接反應(yīng)2 h，并立即轉(zhuǎn)化DH 5 α，并將重組質(zhì)粒送到華大基因測序中心檢測驗(yàn)證序列是否正確。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建策略

按照康為質(zhì)粒小抽質(zhì)粒提取試劑盒說明書，從大腸桿菌DH 5 α中提得PBI 121質(zhì)粒，電泳檢測。在pBI 121的多克隆位點(diǎn)中，本試驗(yàn)選擇使用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切消化pBI 121并且膠回收大片段，并且消化CAX1連接在pMD 18-T載體上并測序正確的序列，用粘性末端連接策略，將CAX1連接在pBI 121的CaMV 35 S啟動子和NOS終止子之間[11],從而構(gòu)建CAX1的植物pBI 121表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌DH 5 α。

1.2.5 單菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果

將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含有卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于10μL無菌水中，取混勻后的菌懸液1μL作為模版，配制20μL的PCR體系，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測結(jié)果[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAX 1開放閱讀框的克隆及測序

以擬南芥cDNA為模板擴(kuò)增，按照實(shí)

驗(yàn)方法1.2.1和1.2.2進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的基因CAX1開放閱讀框，PCR反應(yīng)程序結(jié)束后用10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，獲得了一條亮較濃的1 400 bp左右的DNA片段，如圖1所示，與查得的CAX1基因片段大小一致。

將此片段按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.2和1.2.3繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且酶切進(jìn)行回收，連接在pMD 18-T載體上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，用引物F 1和R 1挑取單克隆做菌落PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2)。圖2中從左至右分別是單菌落1-3、空白、DL 2000 marker、單菌落4-6、DL 2000 marker；樣5和樣6兩條帶明顯，說明質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化。菌落PCR得出正確條帶的菌落繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送出做測序，所得cDNA序列和預(yù)期序列一致(圖3)。

圖1 cDNA PCR擴(kuò)增后CAX 1基因電泳檢測結(jié)果

圖2 菌落PCR驗(yàn)證CAX 1片段

2.2 CAX 1在表達(dá)載體上pBI 121的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切消化測序正確的pMD 18-T載體，切下CAX1片段并且做PCR產(chǎn)物回收，按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4構(gòu)建pBI 121的CaMV 35 S啟動子和NOS終止子之間[13]。pBI 121是從結(jié)瘤農(nóng)桿菌雙元質(zhì)粒帶有GUS基因，能同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌，并且能通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株。本試驗(yàn)用SacⅠ和XbaⅠ酶切消化pBI 121，切除GUS基因，保留了CaMV 35 S啟動子，然后連接CAX1 cDNA序列。

2.3 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

將連接了CAX1 cDNA序列的重組質(zhì)粒pBI 121用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,電泳檢測結(jié)果。從左至右分別是marker、未酶切的重組質(zhì)粒pBI 121和酶切的pBI 121(圖4)，雙酶切獲得一大小在1 400 bp左右條帶，驗(yàn)證了重組表達(dá)質(zhì)粒pBI 121被成功構(gòu)建。

圖4 pBI 121載體重組質(zhì)粒酶切后電泳檢測

3 討 論

研究表明，CAX 1對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度平衡，控制植物正常的生長發(fā)育，以及調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的抗逆如鹽脅迫和低溫脅迫至關(guān)重要[14]。因此，研究植物中CAX 1如何調(diào)控鈣離子運(yùn)輸從而控制相關(guān)抗逆反應(yīng)，影響植物乃至農(nóng)作物的產(chǎn)量有非常重大的意義。35 S啟動子是一種來自于煙草花葉病毒(TMV)強(qiáng)啟動子且表達(dá)非常穩(wěn)定，常用來驅(qū)動外源基因表達(dá)[15]。

本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了pBI 121以35 S啟動子驅(qū)動的CAX1基因的穩(wěn)定表達(dá)載體，接著將會導(dǎo)入到擬南芥cax1的突變體中構(gòu)建互補(bǔ)系，與突變體cax1進(jìn)行比較，是否影響植物抗病。