陳敏,楊曉鳳,宋君

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，成都 610066)

大蒜作為日常生活中常見的調(diào)味品，歷史悠久，而大蒜的特殊風(fēng)味源于大蒜中的含硫化合物。近年來大蒜越來越多的功效被發(fā)現(xiàn)，它被譽(yù)為“天然的養(yǎng)生化妝品”、“天然抗生素”，大蒜在改善糖代謝、心血管疾病、防癌治癌等方面有積極作用[1]。目前，以大蒜為原料生產(chǎn)的各種保健品層出不窮，主要因?yàn)榇笏庵泻幸活愄厥獾纳锘钚晕镔|(zhì)——大蒜素(allicin)[2]，大蒜素的含量是衡量大蒜及大蒜制品質(zhì)量的主要指標(biāo)。然而，大蒜素要從大蒜中提取出來的，首先需要經(jīng)過酶解過程，且大蒜素易揮發(fā)、不穩(wěn)定，所以影響大蒜素提取率的因素有很多，例如酶解溫度、pH值、提取溶劑、體積、溫度、時(shí)間等。大蒜素主要成分二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)的分子量均在200以內(nèi)，本文采用氣相色譜法測定大蒜素，用標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1800-2009提供的方法提取大蒜素，由于酶解溫度太高等原因，導(dǎo)致提取率不理想。本文著重對(duì)影響大蒜素提取率的幾個(gè)重要因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，且在定容步驟之前增加了反萃取步驟，旨在提高大蒜素的提取率，為測定大蒜及大蒜制品中大蒜素的含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮無破損市售大蒜；無水乙醇(≥99.7%，四川西隴化工有限公司)；精確pH試紙(上海三愛思試劑有限公司)；0.01 mol/L NaOH、DADS標(biāo)準(zhǔn)品(Chromdex)、DATS標(biāo)準(zhǔn)品(TRC)、正己烷(Fisher Chemical，色譜純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

7890A FID氣相色譜儀 Agilent公司；DIKW-4 電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHA.B 水浴恒溫振蕩器 金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；IKA○RVORTEX GENIUS3 渦旋儀；R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI公司；JA2003 電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜素的提取方法

將大蒜去皮洗凈，用組織搗碎機(jī)搗成蒜泥，取5 g蒜泥，在一定溫度和pH值條件下酶解一定時(shí)間，后加入一定體積的90%乙醇，在一定條件下振蕩提取大蒜素。提取后過濾，取濾液10 mL，加入正己烷反萃取，然后減壓濃縮至1～2 mL，最終用正己烷定容到5 mL。

1.3.2 大蒜素的檢測方法

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

稱取一定質(zhì)量大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品DADS和DATS，用丙酮配成濃度分別為14908.6，15835.2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于50 mL容量瓶中，用丙酮稀釋到50 mL，配成DADS和DATS濃度分別為298.17，316.70 mg/L的混合溶液。分別取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5,4,3,2 mL,用正己烷稀釋到10 mL，配成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用氣相色譜法測定不同濃度下DADS和DATS的峰面積。

1.3.2.2 檢測條件

色譜柱：HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：160 ℃；柱溫：50～220 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣流速：2 mL/min；空氣流速：400 mL/min；H2流速：40 mL/min。

1.3.2.3 樣品中大蒜素的定量

將實(shí)驗(yàn)中所得的大蒜素樣品用氣相色譜法檢測，通過外標(biāo)法(用較近濃度單點(diǎn)定量)計(jì)算出大蒜素的濃度，進(jìn)而計(jì)算出大蒜素的提取率。

提取率=大蒜素質(zhì)量/大蒜質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 大蒜素成分分析

大蒜素為淡黃色粉末或淡黃色油狀液體，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、苯等有機(jī)物，在0.2 kPa時(shí)沸點(diǎn)為80～85 ℃[3]。

在新鮮的大蒜中，并不存在大蒜素，其最原始的前體物質(zhì)是γ-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸。γ-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸在一定條件下水解氧化產(chǎn)生蒜氨酸(alliin)，蒜氨酸在大蒜細(xì)胞被破壞時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的蒜素，蒜素再分解產(chǎn)生多種揮發(fā)性脂溶性化合物DADS(二烯丙基二硫化物)、DAS(二烯丙基硫化物)、DATS(二烯丙基三硫化物)、二烯丙基四硫化合物等含硫化合物，這些硫醚類化合物統(tǒng)稱為大蒜素[4]。其中含量最多的是二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)[5]。

2.2 酶解條件對(duì)大蒜素提取率的影響實(shí)驗(yàn)

大蒜在未破壞之前是不存在大蒜素的，大蒜破壞之后釋放其內(nèi)源酶——蒜酶，在蒜酶作用下蒜氨酸酶解成大蒜素[6]。要盡可能地提取出大蒜中的大蒜素，則首先要使酶解條件最佳。一般來說，植物體內(nèi)的酶最適溫度在40～50 ℃，最適pH值大多在4.5～6.5。參照此條件，設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 水對(duì)酶解效率的影響

稱取2份5 g蒜泥，一份加入10 mL水，一份未加水，調(diào)節(jié)pH值在6.5，后續(xù)步驟參照NY/T 1800-2009，計(jì)算出大蒜素的提取率，加水之后的提取率較高，故選擇酶解之前加水。

2.2.2 pH值對(duì)酶解效率的影響

稱取2份5 g蒜泥，加入10 mL水，一份調(diào)節(jié)pH值在6.5，一份未調(diào)節(jié)pH值，后續(xù)步驟參照NY/T 1800-2009，計(jì)算出大蒜素的提取率，調(diào)節(jié)pH值后的提取率較高，故選擇酶解之前調(diào)節(jié)pH值。

2.2.3 溫度對(duì)酶解效率的影響

稱取4份5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值在6.5，酶解溫度分別控制在30,40,50,60 ℃，酶解30 min，后續(xù)步驟參照NY/T 1800-2009，計(jì)算出大蒜素的提取量,見圖1。

圖1 酶解溫度對(duì)大蒜素提取率的影響Fig.1 Effect of enzymatic temperature on the yield of allicin

由圖1可知，酶解溫度為50 ℃時(shí)大蒜素提取率最高，故選擇50 ℃為本實(shí)驗(yàn)的酶解溫度。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)大蒜素提取率的影響

稱取2份5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值在6.5，在50 ℃時(shí)，酶解時(shí)間分別控制在30 min和60 min，后續(xù)步驟參照NY/T 1800-2009，計(jì)算出大蒜素的提取率為30 min和60 min相近，故選擇酶解30 min。

2.3 乙醇提取大蒜素的單因素實(shí)驗(yàn)

目前，提取大蒜素的方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界提取法等[7]。綜合各方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及檢測要求，本文采用有機(jī)溶劑萃取法[8]。由于大蒜素易溶于乙醇、乙醚、苯等有機(jī)物，故采用無毒無害的90%乙醇作為提取溶劑。

2.3.1 料液比對(duì)大蒜素提取率的影響

稱取4份5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值為6.5，40 ℃酶解30 min，分別加入15,20,25,30 mL 90%乙醇(即料液比分別為1∶3,1∶4,1∶5,1∶6)振蕩提取1 h(60 ℃，120 r/min)。抽濾，取10 mL濾液，然后加入20 mL正己烷于濾液中，渦旋2 min，靜置，取上清液上機(jī)檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)大蒜素提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of allicin

由圖2可知，用乙醇提取大蒜中的大蒜素，料液比在1∶6時(shí)提取率較高。

2.3.2 提取溫度對(duì)大蒜素提取率的影響

稱取5份5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值為6.5，40 ℃酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，分別在40,50,60,65,70 ℃振蕩提取1 h(120 r/min)。抽濾取10 mL濾液，然后加入20 mL正己烷于濾液中，渦旋2 min，靜置，取上清液上機(jī)檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)大蒜素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of allicin

由圖3可知，用乙醇提取酶解后大蒜中的大蒜素，提取溫度對(duì)提取率的影響很大，30～65 ℃呈上升趨勢，且速度越來越快，70 ℃時(shí)開始下降，所以選擇65 ℃作為本實(shí)驗(yàn)的提取溫度。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)大蒜素提取率的影響

稱取5份5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值為6.5，40 ℃酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，分別振蕩提取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h(65 ℃,120 r/min)。抽濾取10 mL濾液，然后加入20 mL正己烷于濾液中，渦旋2 min，靜置，取上清液上機(jī)檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)大蒜素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of allicin

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，大蒜素提取率較高，故選擇提取時(shí)間為2 h。

2.4 用正己烷反萃取乙醇中大蒜素的實(shí)驗(yàn)

在NY/T 1800-2009 標(biāo)準(zhǔn)中，用5 mL正己烷反萃取15 mL乙醇溶液中的大蒜素。但大蒜素在乙醇中的溶解度比在正己烷中的更大，根據(jù)萃取原理，這種情況下的萃取率是不理想的，故設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證萃取體積對(duì)大蒜素提取率的影響[9]。

2.4.1 正己烷體積對(duì)大蒜素提取率的影響

取大蒜素(DADS,DATS)標(biāo)準(zhǔn)液(用丙酮配制)，先用丙酮稀釋成1490.86 mg/L(DADS)和1583.52 mg/L(DATS)的溶液10 mL，再用90%乙醇稀釋成一定濃度的混合液。最終二烯丙基二硫化物(DADS)濃度為149.09 mg/L，二烯丙基三硫化物(DATS)濃度為158.35 mg/L(此濃度接近定容后的大蒜素濃度)。準(zhǔn)確量取5份該混合液各10 mL于離心管中，分別加入5，10，15，20，25 mL正己烷渦旋2 min。上機(jī)檢測并計(jì)算大蒜素提取率，見圖5。

圖5 萃取體積對(duì)大蒜素提取率的影響Fig.5 Effect of extraction volume on the yield of allicin

提取率隨著正己烷體積的增大而增大，增大趨勢逐漸減緩，綜合提取率和綠色化學(xué)兩方面考慮，用20 mL正己烷反萃取10 mL乙醇中的大蒜素。

2.4.2 旋蒸溫度及真空度對(duì)大蒜素提取率的影響

取大蒜素(DADS,DATS)標(biāo)準(zhǔn)液(用丙酮配制)，先用丙酮稀釋成1490.86 mg/L(DADS)和1583.52 mg/L(DATS)的溶液10 mL，再用90%乙醇稀釋成一定濃度的混合液。最終二烯丙基二硫化物(DADS)濃度為149.09 mg/L，二烯丙基三硫化物(DATS)濃度為158.35mg/L(此濃度接近定容后的大蒜素濃度)。準(zhǔn)確量取12份該混合液各10 mL于離心管中，分別加入20 mL正己烷渦旋2 min[10]。其中2份直接上機(jī)檢測大蒜素濃度，作為理論提取量，另外10份在不同溫度和真空度下旋蒸到剩下1～2 mL正己烷，用正己烷定容到5 mL，上機(jī)檢測，并計(jì)算大蒜素提取率，見表1。

表1 大蒜素提取率Table 1 The yeild of allicin

由表1可知，30 ℃，0.075 MPa時(shí)，未見明顯的旋蒸餾分，故選擇在30 ℃，0.078 MPa時(shí)旋蒸，損失率最低。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化方法

稱取5 g蒜泥，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH值到6.5，在50 ℃時(shí)酶解30 min，加入30 mL 90%乙醇，65 ℃時(shí)，120 r/min在水浴振蕩器中振蕩提取120 min，抽濾后取10 mL濾液，并加入20 mL正己烷，渦旋2 min，取上層液體，在30 ℃，0.078 MPa時(shí)旋蒸至正己烷剩下1～2 mL，用正己烷定容到5 mL，F(xiàn)ID上機(jī)檢測。

3.2 本實(shí)驗(yàn)所確定方法與NY/T 1800-2009方法比較

稱取2份5 g蒜泥，按NY/T 1800-2009處理[11]，用FID上機(jī)檢測，比較2種前處理方法的大蒜素提取率，見表2。

表2 2種前處理方法的大蒜素提取率Table 2 The yeild of allicin with two pretreatment methods

通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)，優(yōu)化條件下的大蒜素提取率比NY/T 1800-2009標(biāo)準(zhǔn)方法的提取率增加42.4%，且優(yōu)化方法的操作簡單，可以作為日常檢測大蒜及大蒜制品中大蒜素含量的方法。由于影響大蒜素提取率的因素較多，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中可能存在不足，需進(jìn)一步論證。