任玉琴 ，裘丞軍，吳望君

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所, 杭州 311199)

泰樂(lè)菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要用于敏感菌引起的畜禽各種革蘭氏陽(yáng)性菌、支原體感染，磺胺二甲嘧啶為磺胺類抗菌藥，為廣譜抑菌劑。泰樂(lè)菌素和磺胺二甲嘧啶制成的復(fù)方制劑，在作用機(jī)理上具有累加作用，主要用于治療畜禽革蘭氏陽(yáng)性菌和支原體感染，也用于預(yù)防豬痢疾[1]，市場(chǎng)上應(yīng)用最早的為“磷酸泰樂(lè)菌素、磺胺二甲嘧啶預(yù)混劑”[2]，被收載于《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版，“酒石酸泰樂(lè)菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉”[3]作為地方標(biāo)準(zhǔn)上升到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，被收載于《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編》第一冊(cè)(獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))，該產(chǎn)品也是我國(guó)獸藥企業(yè)生產(chǎn)較多的一個(gè)品種，獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編中，泰樂(lè)菌素含量采用生物效價(jià)法測(cè)定、組分采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定，磺胺二甲嘧啶(SM2)含量采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，方法繁鎖?；前奉惤Y(jié)構(gòu)中均存在共軛雙鍵，在紫外區(qū)有吸收，特別是SM2與磺胺嘧啶有相同的官能團(tuán)，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定含量和最大吸收波長(zhǎng)作為鑒別，專屬性不強(qiáng)。在動(dòng)物源性食品中SM2殘留測(cè)定均采用HPLC或LC/MS-MS法測(cè)定[4-6]，陶彌峰[7]建立了液相色譜法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)品中磺胺類的殘留；徐恩民[8]等對(duì)氟苯尼考制劑中SM2等測(cè)定進(jìn)行了研究；包潔華[9]等用HPLC法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)的研究；HPLC法測(cè)定磺胺二甲嘧啶和泰樂(lè)菌素[10-12]已在各個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。為此本文對(duì)泰樂(lè)菌素組分、磺胺二甲嘧啶含量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，建立了用HPLC法同時(shí)測(cè)定磺胺二甲嘧啶和泰樂(lè)菌素組分含量，方法簡(jiǎn)便、快速，專屬性強(qiáng)。

1 材 料

1.1 試劑和藥品 市售酒石酸泰樂(lè)菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉，批號(hào)：13022501、20140301、14030601；泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)K0161305；磺胺二甲嘧啶對(duì)照品，批號(hào)：H0371008，含量99.8%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑?qū)φ掌穪?lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺氯噠嗪鈉、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺脒、磺胺甲氧噠嗪對(duì)照品均來(lái)源于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；Waters2690高效液相色譜儀；UV-2550紫外分光光度計(jì)；Mettler Toledo電子天平。

2 方法和結(jié)果

2.1 磺胺二甲嘧啶含量測(cè)定方法學(xué)建立

2.1.1 液相色譜條件 以ECOSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；流動(dòng)相：2 mol/L高氯酸鈉溶液(用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至2.5±0.1)-乙腈，采用梯度洗脫方法(表1)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Mobile phase gradient elution program

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取磺胺二甲嘧啶對(duì)照品適量，加0.1 mol/L HCl溶液溶解制成20 μg/mL溶液；取泰樂(lè)菌素對(duì)照品約35 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度，將磺胺二甲嘧啶與泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果磺胺二甲嘧啶和泰樂(lè)菌素4個(gè)組分有較好的分離，泰樂(lè)菌素D峰與A峰的分離度≥3.2；泰樂(lè)菌素C峰與磺胺二甲嘧啶分離度≥30(圖1)。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 取2.1.2項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果磺胺二甲嘧啶在243 nm處有最大吸收、在300 nm處有次吸收，酒石酸泰樂(lè)菌素在300 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，2010版《中國(guó)獸藥典》[13]酒石酸泰樂(lè)菌素組分檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，美國(guó)藥典(USP)[14]和歐州藥典(EP)[15]標(biāo)準(zhǔn)中泰樂(lè)菌素組分檢測(cè)波長(zhǎng)均為290 nm，因此選擇280 nm、290 nm進(jìn)行考察。

按擬定的色譜條件，采用雙波長(zhǎng)測(cè)定，結(jié)果磺胺二甲嘧啶在280 nm處的響應(yīng)值略高于290 nm，泰樂(lè)菌素C、B、D、A組分在290 nm的響應(yīng)值略高于280 nm，因此本方法檢測(cè)波長(zhǎng)選擇280 nm，與《中國(guó)獸藥典》一致。

圖1 磺胺二甲嘧啶和酒石酸泰樂(lè)菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖素Fig 1 Chromatograph of sulfadimidine and tylosin tartrate standard mixture

C2.1.4 磺胺二甲嘧啶定量限和檢測(cè)限考察 取磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.1.2項(xiàng))適量，用水稀釋成不同的上機(jī)濃度，按上述色譜條件上機(jī)分析，結(jié)果上機(jī)濃度為0.05 μg/mL ,其S/N=3.9；上機(jī)濃度為0.15 μg/mL ,其S/N=13，磺胺二甲嘧啶檢出限為0.05 μg/mL：定量限0.15 μg/mL，見(jiàn)圖2、圖3。

2.1.5 磺胺二甲嘧啶線性考察 取磺胺二甲嘧啶對(duì)照品約20 mg，置50 mL量瓶，加0.1 mol/L HCl溶解至刻度，搖勻，精密量取適量，用水稀釋成濃度為10、20、40、80、160、200 μg/mL的上機(jī)液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果線性方程：y=48.618X-63.982，R2=0.9994，在10～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

圖2 磺胺二甲嘧啶檢出限(S/N=3.9)Fig 2 Tylosin limit of detection (S/N=3.9)

圖3 磺胺二甲嘧啶定量限(S/N=13)Fig 3 Tylosin limit of quantitation(S/N=13)

2.1.6 磺胺二甲嘧啶準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 模擬“酒石酸泰樂(lè)菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉”處方：10%酒石酸泰樂(lè)菌素+10%磺胺二甲嘧啶+10%無(wú)水碳酸鈉，用無(wú)水葡萄糖加至100%。按處方量的80%、100%、120%添加磺胺二甲嘧啶、酒石酸泰樂(lè)菌素，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。每一濃度制備4～5份，分別置50 mL容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻；另稱取磺胺二甲嘧啶對(duì)照品9.75 mg，置50 mL容量瓶，加0.1 mol/L HCL溶液溶解至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進(jìn)行分析，精密量取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 磺胺二甲嘧啶準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Accuracy and precision of tylosin measurements

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，磺胺二甲嘧啶含量測(cè)定平均回收率在99.7%～100.1%間，RSD為0.3%～0.5%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。

2.1.7 磺胺二甲嘧啶含量測(cè)定上機(jī)液放置穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為14030601 、13022501和20140301樣品，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用水定量稀釋制成每1 mL中約含磺胺二甲嘧啶0.08 mg/mL的溶液，按上述色譜條件，放置不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定，結(jié)果磺胺二甲嘧啶峰面積變化極小，該方法中溶液非常穩(wěn)定(表3)。

表3 含量測(cè)定溶液放置穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 3 Sample stability test

2.1.8 方法專屬性試驗(yàn)

2.1.8.1 磺胺類產(chǎn)品干擾試驗(yàn) 《中國(guó)獸藥典》2010年版共收載了磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪鈉、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺脒、磺胺甲氧噠嗪11種磺胺類產(chǎn)品，取上述對(duì)照品適量，加0.1 mol/L HCl溶液溶解制成20 μg/mL溶液；另取泰樂(lè)菌素對(duì)照品約35 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度。

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果磺胺二甲嘧啶與另10種磺胺類、泰樂(lè)菌素4個(gè)組分均能有效分離，見(jiàn)圖4?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液組分出峰順序依次為：磺胺脒、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪+磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺喹噁啉、泰樂(lè)菌素C、泰樂(lè)菌素B、泰樂(lè)菌素D和泰樂(lè)菌素A。

圖4 酒石酸泰樂(lè)菌素和11種磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig 4 Chromatograph of tylosin tartrate and sulfonamides standard mixture

2.1.8.2 酸降解試驗(yàn) 取酒石酸泰樂(lè)菌素與11種磺胺類對(duì)照品約15 mg，置25 mL容量瓶，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，放置2.5 h，用NaOH溶液調(diào)pH值至中性，按上述色譜條件上機(jī)測(cè)定，結(jié)果酒石酸泰樂(lè)菌素在酸性環(huán)境中降解明顯，磺胺二甲嘧啶與各降解峰分離良好，見(jiàn)圖5。

圖5 酸降解后酒石酸泰樂(lè)菌素和磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig 5 Chromatograph of sulfonamides standard mixture and tylosin tartrate after acid hydrolysis

2.1.8.3 堿降解試驗(yàn) 磺胺二甲嘧啶在堿性條件下較穩(wěn)定，因此本方法僅對(duì)酒石酸泰樂(lè)菌素進(jìn)行堿降解試驗(yàn)。取酒石酸泰樂(lè)菌素對(duì)照品約15 mg，置25 mL容量瓶，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，放置5 h，用HCL溶液調(diào)pH值至中性，按上述色譜條件分析，結(jié)果酒石酸泰樂(lè)菌素在堿性環(huán)境中降解徹底，各降解峰對(duì)磺胺二甲嘧啶峰無(wú)干擾，見(jiàn)圖6。

圖6 酒石酸泰樂(lè)菌素堿降解色譜圖Fig 6 Chromatograph of tylosin tartrate after alkaline hydrolysis

2.1.8.4 氧化破壞試驗(yàn) 取批號(hào)為13022501樣品約0.2 g，加30%過(guò)氧化氫溶液5 mL，放置3 h，加水至25 mL，按上述色譜條件分析，結(jié)果酒石酸泰樂(lè)菌素主峰全部降解，各降解峰與磺胺二甲嘧啶主峰分離良好(圖7、圖8)。

圖7 批號(hào)13022501樣品溶液色譜圖Fig 7 Chromatograph of Sample 13022501

圖8 批號(hào)13022501樣品氧化破壞色譜圖Fig 8 Chromatograph of Sample 13022501 after oxidation

2.1.9 方法耐用性考察 取2.1.2項(xiàng)下的溶液，按上述色譜條件，通過(guò)不同品牌的色譜柱，小幅改變流動(dòng)相比例、柱溫及不同液相色譜儀，考察該色譜條件的耐用性，結(jié)果磺胺二甲嘧啶與泰樂(lè)菌素分離度、峰面積未受影響，該方法有較好的重現(xiàn)性。

2.2 泰樂(lè)菌素組分測(cè)定

2.2.1 按擬定的方法測(cè)定 取樣品約0.35g與泰樂(lè)菌素對(duì)照品約35 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度，照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件試驗(yàn)，以泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中C、B、D、A主組分峰定性供試品溶液的主組分峰，按峰面積歸一化法(除磺胺二甲嘧啶峰外)計(jì)算，結(jié)果泰樂(lè)菌素D峰與泰樂(lè)菌素A峰的分離度≥3.2；泰樂(lè)菌素C峰與磺胺二甲嘧啶分離度R≥30，泰樂(lè)菌素A峰拖尾因子0.93；理論板數(shù)按泰樂(lè)菌素A計(jì)算為20507，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)均符合要求，樣品考察結(jié)果該色譜條件有較好的重現(xiàn)性。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.2 按《中國(guó)獸藥典》方法對(duì)泰樂(lè)菌素組分定性考察 取泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按《中國(guó)獸藥典》2010年版方法制備上機(jī)溶液和測(cè)定，結(jié)果泰樂(lè)菌素C、B、D、A組分的相對(duì)保留時(shí)間為0.49、0.76、0.82、1，而標(biāo)準(zhǔn)品附帶的色譜圖中相對(duì)保留時(shí)間為0.61、0.72、0.8、1， C、B、D組分與《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的0.5、0.7、0.8有一定的出入。

表4 泰樂(lè)菌素組分檢查結(jié)果Tab 4 Tylosin component test results

3 討論與結(jié)論

通過(guò)酸、堿、氧化破壞、同類產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)及方法耐用性考察，結(jié)果顯示11種磺胺類產(chǎn)品和泰樂(lè)菌素組分在該色譜條件中有較好的專屬性和重現(xiàn)性。該方法的建立，能同時(shí)完成磺胺二甲嘧啶含量和泰樂(lè)菌素組分測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，能有效甄別其他磺胺類成分的非法添加，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供較好的技術(shù)支持。

《中國(guó)獸藥典》收載了眾多的泰樂(lè)菌素系列產(chǎn)品，均采用相對(duì)保留時(shí)間來(lái)定位C、B、D、A組分，但在實(shí)際操作中，不同品牌、不同規(guī)格色譜柱影響組分的相對(duì)保留時(shí)間，定位有一定難度，給檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來(lái)影響。USP 36版也采用相對(duì)保留時(shí)間來(lái)定位泰樂(lè)菌素組分，EP 7.0版采用對(duì)照品C、B、D、A組分定性樣品中組分，目前泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品附帶含C、B、D、A組分色譜圖，用泰樂(lè)菌素C、B、D、A組分對(duì)照品來(lái)定性樣品中的組分能有效解決當(dāng)前組分定性的不準(zhǔn)確。