王亞芳，鐘昆芮，李應超，周艷飛，張小飛，高 婷，秦俊杰，王海軍，戰(zhàn) 皓*

(1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107； 2.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206； 3.北京市中獸藥工程技術研究中心，北京 102206)

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort. 的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主要包括吲哚類、喹唑酮類、芥子苷類、有機酸類和核苷類等化合物[1-3]。板藍根顆粒由單味藥材板藍根經(jīng)提取、濃縮、加工而成，我公司根據(jù)《中國藥典》2015版一部中板藍根顆粒處方提取制備成便于臨床應用的新獸用產(chǎn)品，清熱解毒，涼血利咽，用于治療雞傳染性法氏囊病，豬風熱感冒等癥。獸用板藍根顆粒市場基數(shù)大，生產(chǎn)企業(yè)魚龍混雜，存有企業(yè)在原材料收購、飲片加工和成藥生產(chǎn)過程中不規(guī)范環(huán)節(jié)，導致產(chǎn)品質量參差不齊，無法保證藥效，需要制定一種質量標準對板藍根顆粒的產(chǎn)品質量進行控制。

板藍根中核苷類成分，尤其是腺苷，具有抗炎、抗凝血、擴張冠狀動脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心律不齊的作用，可以通過參與并干擾細菌病毒的基因表達過程，從而起到一定的抗病毒作用[4-7]。《中國藥典》中僅以亮氨酸、精氨酸為對照作為定性鑒別項，無質量控制標準。為了更好的控制板藍根顆粒的質量，本研究將活性成分腺苷作為指標性成分，對其含量測定方法進行研究，為進一步完善板藍根顆粒的質量控制提供了依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Waters1525高效液相色譜儀，2487雙通道可調波長紫外檢測器，美國waters公司；Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，美國waters公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 板藍根顆粒批號：080305、080307、080310、080312、080315、080317、080320、080322、080324、080326，北京生泰爾技術研究院試制產(chǎn)品；腺苷對照品，批號：110879-200202，購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(10∶90)；檢測波長：260 nm；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液的制備 稱取腺苷對照品約10 mg，精密稱定，置50 mL的容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細，精密稱定2 g，置具塞三角瓶中，加20 mL水超聲處理15 min，取出，放置至室溫，過濾，濾液轉移至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關系考察 精密量取腺苷對照品儲備液，逐級稀釋得到濃度分別為4、8、12、16、20 μg/mL的溶液，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過。按上述色譜條件分別進樣20 μL，測定峰面積。以腺苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示腺苷濃度在4～20 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程y=71169x-6732，R2=0.9999。

2.5 精密度試驗 精密吸取腺苷對照品溶液20 μL，在上述色譜條件下重復進樣6次，測定峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)，試驗結果見表1。經(jīng)過計算，RSD=0.06%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗測定結果 (n=6)Tab 1 Precision test results (n=6)

2.6 重現(xiàn)性試驗 稱取板藍根顆粒粉末，在不同實驗室分別由6個分析人員，平行制備6份供試品溶液，分別測定，根據(jù)峰面積值，計算腺苷含量及RSD值，試驗結果見表2。結果顯示腺苷平均含量為0.184 mg/g，RSD為1.50%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性試驗結果(n=6)Tab 2 Reproducibility test results (n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進行測定。根據(jù)峰面積值，計算腺苷含量及RSD值，見表3。結果顯示腺苷平均含量0.180 mg/g，RSD為0.43%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗結果(n=6)Tab 2 Stability test results (n=6)

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的板藍根顆粒樣品6份，每份約1.0 g，精密稱取，分別精密加入適量腺苷對照品，按上述樣品溶液制備方法和色譜條件測定峰面積，計算腺苷的加樣回收率及RSD值，結果見表4。結果顯示，腺苷的平均加樣回收率為96.62%(RSD=1.08%)。

表4 加樣回收率實驗結果(n=6)Tab 4 Experimental results of recovery

2.9 樣品測定 取10批板藍根顆粒樣品，分別按上述樣品溶液制備方法和色譜條件，測定峰面積，計算腺苷含量和RSD值，含量測定結果見表5，色譜圖見圖1。由表5可知，板藍根顆粒中腺苷的含量為0.182 mg/g(RSD=1.52%)；圖1所得到的液相色譜圖峰型較對稱，分離度高，保留時間適當。表明該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好且穩(wěn)定。

表5 板藍根顆粒中腺苷含量測定結果(n=3)Tab 5 Determination of adenosine content in Banlangen Granule(n=3)

(a：腺苷)(a: adenosine)圖1 腺苷對照品(A)及供試品溶液(B)色譜圖Fig 1 Chromatograms of adenosine(A)and sample(B)of Banlangen Granule

3 討論與結論

3.1 流動相比例的考察 本研究分別考察了甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液以12∶88，10∶90 比例下的色譜效果。當甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液比例為12∶88時，腺苷的保留時間為15.8min，但色譜峰容易受到雜質峰干擾；將比例稍作調整，當比例為10∶90時，腺苷保留時間為17.3 min，腺苷峰分離度高，故選擇流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(10∶90)。

3.2 流速的考察 本研究分別以流速0.8、1、1.2 mL/min進行優(yōu)選。當流速為0.8 mL/min時，腺苷的保留時間為27.3 min，出峰較慢；當流速為1.0 mL/min時，腺苷保留時間為20.9 min，出峰時間較理想，但有拖尾現(xiàn)象；當流速為1.2 mL/min時，腺苷的保留時間為17.3 min，腺苷峰分離度高且保留時間適宜，故選擇流速為1.2 mL/min。

3.3 測定結果分析 本研究對10批板藍根顆粒樣品中腺苷的含量進行了測定，由測定結果可知，同一批樣品腺苷含量較穩(wěn)定，且10批樣品腺苷含量范圍為 0.178～0.188 mg/g，表明板藍根顆粒制備方法穩(wěn)定、重復性能較好。同時，以相同制備方法和色譜條件對3個廠家的獸用板青顆粒中腺苷含量進行檢測，結果顯示，腺苷含量范圍為0.006～0.098 mg/g，不同廠家樣品中腺苷含量差異顯著，其內(nèi)在質量差異較為明顯。

本研究所建立的含量測定方法，腺苷與板藍根顆粒中其他組分可以得到較好的分離，實驗操作簡單、快速、穩(wěn)定且重復性良好，同時為板藍根顆粒的質量控制提供了一種新方法。此外，板藍根顆粒中有效成分眾多，如何更全面的反應板藍根顆粒的內(nèi)在質量，研究報道甚少，亦有待進一步研究。