林 紅，徐恩民，鄭 莉，馮言言，孟 芳，孔 梅，吳連勇

(1.齊魯動物保健品有限公司，濟南250100；2.山東省獸藥質量檢驗所，濟南250022)

美洛昔康[1]是一種新型烯醇酰胺類的非甾體類抗炎藥物(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug，NSAID)，作用機制主要是抑制前列腺素(Prostaglandins，PGs)環(huán)氧化酶，阻止花生四烯酸轉化為PGs而發(fā)揮抗炎、止痛和解熱作用，而且毒副反應小。袁占奎等[2]報道，股骨頭切除術是寵物臨床上常見的手術，可繼發(fā)骨關節(jié)炎等，其手術過程中及術后恢復期均會對犬產(chǎn)生很大的疼痛應激。李凱年報道，骨關節(jié)炎[3]是犬的一種退行性骨關節(jié)疾病，也是犬的一種比較多發(fā)的疾病。李彥等報道，犬髖關節(jié)發(fā)育不良(Canine Hip Dysplasia CHD)是一種以遺傳性為基礎的后天發(fā)育畸形，是由多種病因導致的復合性疾病。炎癥和疼痛是其臨床適應癥之一。美洛昔康作為一類常用的NSAID，在臨床上廣泛用于骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、多種發(fā)熱和各種疼痛癥狀的緩解，與其他非甾體類抗炎藥相比，嚴重胃腸道等不良反應的發(fā)生率明顯降低。

美洛昔康于2000年6月獲FDA批準，用于緩解骨關節(jié)炎癥狀。德國Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc作為原研廠家，F(xiàn)DA和歐盟先后批準了多家公司生產(chǎn)的美洛昔康注射液、口服溶液、片劑等一系列產(chǎn)品，從批準上市以來，在靶動物犬等獸醫(yī)臨床上廣泛應用，未見不良反應報道。通過本研究可了解比格犬對美洛昔康片的臨床不良反應和中毒劑量對犬的組織病理學和生理生化指標的影響，提出美洛昔康片的不良反應、防治措施及臨床應用時的注意事項，以確保臨床用藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 受試藥物和試劑 美洛昔康片，規(guī)格2.5 mg/片；批號：1307002，由齊魯動物保健品有限公司提供。生理生化分析配套試劑，結晶紫染液，中性紅染液，蒸餾水等。

1.2 儀器設備 ARCO PC型全自動生化分析儀，意大利BIOTECNICA公司；Hemastar II型血液分析儀，法國Yoder公司；RM2235切片機，德國萊卡公司。

1.3 試驗動物 三色健康比格犬24只，12～16月齡，體重11.4～14.2 kg左右，雌雄各半，由北京海淀區(qū)蘇家坨比格犬試驗場提供。所有比格犬均已經(jīng)多聯(lián)苗免疫和驅蟲處理?；A日糧不含任何藥物添加劑，飼養(yǎng)籠內(nèi)封閉式飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.4 試驗分組及給藥[4]將比格犬隨機分成4個組，每組6只，雌雄各半，試驗前預飼7 d，臨床觀察健康后，各試驗組犬按試驗設計給藥，試驗周期21 d。每日上午8點給藥，試驗分組及給藥如表1。

表1 試驗分組及給藥Tab 1 The test group and drug administration

1.5 試驗檢測指標

1.5.1 采食量、日增重及飼料轉化率 在試驗開始給藥前(0 d)和最后一次給藥后(給藥第7天)分別按組別稱量犬只體重，稱重均在早晨空腹進行，同時記錄各組犬的采食量，計算平均日耗料量，進而計算其飼料轉化率(耗料/增重)。

1.5.2 臨床表現(xiàn)(大小便、外觀行為，體溫、呼吸頻率和脈搏) 試驗前觀察一周，觀察犬的行為、活動、飲水、攝食、毛發(fā)、精神、體重等，穩(wěn)定后進行試驗。整個試驗期，每日于給藥后觀察并記錄各組犬的健康狀況和臨床表現(xiàn)(大小便、外觀行為、體溫、呼吸頻率和脈搏等)，記錄死亡數(shù)，并計算各組的死亡率和成活率。一般觀察：每天上午和下午給藥后觀察記錄犬的一般體征，并于給藥前測定犬的體溫、呼吸頻率和脈搏，發(fā)現(xiàn)有反應的犬重點觀察。

1.5.3 血液生理指標 犬血液生理指標委托動物醫(yī)學院國家獸藥安全評價中心進行實驗室檢測分析。在試驗開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d對各組犬進行臂頭靜脈采血，進行白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、血小板計數(shù)(PLT)等血液生理指標測定。

1.5.4 血液生化指標 犬血液生化指標委托動物醫(yī)學院國家獸藥安全評價中心進行實驗室檢測分析。在試驗開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d對各組犬進行臂頭靜脈采血，進行丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)等血液生化指標測定。

1.5.5 大體剖檢 對試驗過程中的死亡犬，以及試驗結束后全部5×推薦劑量組和空白對照組(必要時包括3×推薦劑量組)的犬進行安樂死，進行大體剖檢。

1.5.6 組織病理學檢查 對于空白對照組和5×推薦劑量組犬實施安樂死，分別取心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、胃等組織進行固定、包埋，使用切片機進行常規(guī)石蠟切片，之后進行H.E.染色和組織病理學檢查。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 用統(tǒng)計學軟件SPSS14.0進行方差分析和X2(卡方)檢驗分析各組之間的日增重、飼料轉化率、血液生理生化指標的差異顯著性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 各劑量組犬采食量、日增重及飼料轉化率比較 藥物對動物體重的影響：整個試驗期間，空白對照組、1×推薦劑量組和3×推薦劑量組、5×推薦劑量組比格犬體重增加無明顯影響，體重隨時間延長而增加，與空白對照組犬相比差異不顯著(P>0.05)，說明連續(xù)大劑量給予美洛昔康片不會較大程度改變動物體重，對飼料轉化率影響不大，說明動物的機體代謝水平仍維持在正常生理狀態(tài)。結果見表2。

表2 各組比格犬在給藥前后的采食量、日增重和飼料轉化率Tab 2 Food intake, weight gain, feed conversion ratio of beagle dogs in each group before and after treatment

2.2 各劑量組犬臨床表現(xiàn)(體溫、脈搏和呼吸頻率)比較 對所有比格犬連續(xù)給藥7 d期間，觀察其行為未見異常、活動自如、皮毛光亮、口眼鼻耳無分泌物、攝食飲水正常、大便正常、尿顏色正常，未見任何明顯毒副作用，也未發(fā)現(xiàn)動物死亡。不同組別比格犬體溫、脈搏和呼吸頻率均在正常參考值范圍之內(nèi)，見圖A～圖C。

2.3 各劑量組犬血液生理、生化指標比較 血液學指標檢查：在試驗開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d的采血進行血液學生理指標檢查，結果表明：試驗組與對照組犬血液學指標均在犬正常生理指標范圍之內(nèi)，因此未進行統(tǒng)計學分析(表3～表5)。

血清生化指標檢查：在試驗開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d進行血清生化指標檢查，數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件計算各指標的平均值與標準差，結果表明：試驗組與對照組生化指標均在正常范圍之內(nèi)，之間無顯著差異(見表6～表8)。

圖A 各組比格犬給藥后不同時間點體溫情況Fig A Body temperature of dogs at different time after treatment

圖B 各組比格犬給藥后不同時間點脈搏情況Fig B Pulse of dogs at different time after treatment

圖C 各組比格犬給藥后不同時間點呼吸頻率情況Fig C Respiratory rate of dogs at different time after treatment

表3 各組比格犬在試驗開始給藥前(0 d)時血液生理指標值Tab 3 Hematology index value of beagle dogs before treatment(day 0)

表4 各組比格犬在給藥后3 d時血液生理指標值Tab 4 Hematology index value of beagle dogs after treatment(day 3)

表5 各組比格犬在最后一次給藥后(7 d)時血液生理指標值Tab 5 Hematology index value of beagle dogs after treatment(day 7)

續(xù)表

表6 各組比格犬在試驗開始給藥前(0 d)時血液生化指標值Tab 6 Biochemistry parameters value of beagle dogs before treatment(day 0)

表7 各組比格犬在給藥后3 d時血液生化指標值Tab 7 Biochemistry parameters value of beagle dogs after treatment(day 3)

表8 各組比格犬在最后一次給藥后(7 d)時血液生化指標值Tab 8 Biochemistry parameters value of beagle dogs after treatment(day 7)

2.4 空白對照組和5×推薦劑量組犬大體剖檢結果

從正常比格犬與5×推薦劑量組比格犬大體剖檢來看，心包膜和心臟、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等，被膜顏色正常，臟器表面無異常，邊緣整齊，無出血點或壞死病癥，說明5×推薦劑量連續(xù)給藥7 d對犬臟器無肉眼可見的不良影響。

2.5 空白對照組和5×推薦劑量組犬組織病理學檢查結果

2.5.1 空白對照組犬不同組織病理學觀察 組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照犬的各個主要內(nèi)臟器官結構完整清晰，可作為對照使用。

2.5.2 5 ×推薦劑量組犬組織病理學觀察 對采集的6只5×推薦劑量犬的心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胃(共6種)組織進行固定、包埋，使用切片機進行常規(guī)石蠟切片，之后進行H.E.染色，其結果見表9。

表9 5×推薦劑量組犬組織病理學觀察結果Tab 9 Histopathological observation of dogs of 5 times recommended dosage group

經(jīng)觀察可見，該犬心肌纖維排列致密整齊，心肌細胞細胞核完整(圖D)；肝臟有一定程度的肝細胞空泡化(圖E)；肺臟的肺泡壁完整，肺泡腔內(nèi)透亮(圖F)；脾臟結構清晰，可見脾小梁、白髓區(qū)的脾小結、中央動脈和紅髓區(qū)的血竇等結構(圖G)；腎小管管腔中有絮狀物質沉著(圖H)；胃黏膜上皮細胞上有炎性物質滲出(圖I)。

圖D 19號犬心臟(40X)Fig D Heart of No.19 dog(40X)

圖E 20號犬肝臟(40X)Fig E Liver of No.20 dog(40X)

圖F 21號犬肺臟(40X)Fig F Lung of No.21 dog(40X)

圖G 22號犬脾臟(10X)FigG Spleen of No.20 dog(40X)

圖H 22號犬腎臟(40X)Fig H Kidney of No.22 dog(40X)

圖I 23號犬胃(10X)Fig I Stomach of No.23 dog(40X)

3 討論與結論

原研單位報道了6～8月齡的比格犬使用美洛昔康后的安全性，將犬隨機分成4組，首次皮下注射0、0.2、0.4、0.6 mg/kg bw的美洛昔康注射液，然后按0.1mg/kg bw劑量每天內(nèi)服美洛昔康混懸液，連用6 d。觀察并記錄犬的臨床癥狀、體重、采食和飲水量，7 d后所有犬進行尸體剖檢。結果發(fā)現(xiàn)，犬未表現(xiàn)臨床不良反應，體重、采食量、飲水量未受影響；第4 d對照組的一只母犬和第5天中劑量組的一只公犬的糞便測定為潛血陽性，其他樣品均為陰性，這與該品種和年齡犬的預期情況一致。血液生理學和生化參數(shù)中未發(fā)現(xiàn)與臨床治療有關的變化。尸檢時，胃腸道中未觀察到潰瘍和出血；治療前后，犬表現(xiàn)短暫的胃腸道癥狀，如嘔吐、糞便變軟和腹瀉，這與EMA的報道一致，但因清洗期也出現(xiàn)了類似癥狀，因此認為這與治療無關。綜上說明美洛昔康在犬注射和內(nèi)服應用的安全性較高。美洛昔康片作為內(nèi)服劑型，經(jīng)試驗證明其與內(nèi)服混懸液是生物等效的，推斷美洛昔康片在犬應用是安全的。

劉宏[5]研究了美洛昔康片對犬的安全性。試驗選取24只10 kg左右的健康中華田園成年犬，公母各半，隨機分為4組，每組6只。試驗設空白對照組(0 mg/kg bw)、臨床推薦劑量組(0.1 mg/kg bw)、3倍臨床推薦劑量組(0.3 mg/kg bw)、5倍臨床推薦劑量組(0.5 mg/kg bw)。每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。通過與劉宏的研究發(fā)現(xiàn)，給藥7 d后，我們測定的紅細胞數(shù)與其數(shù)據(jù)一致，但白細胞數(shù)量偏低，這可能與所用試驗動物的種類不同有關，但都在正常生理范圍內(nèi)，且正常生理范圍值一致。血液生化測定指標中，1、3、5倍的天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的測定結果雖然略有差別，但與空白對照組相比，都有升高的趨勢。這兩個試驗結果都表明，犬服用美洛昔康片后各項生理生化指標均在正常生理范圍內(nèi)，說明其臨床應用是安全的。

袁震[6]報道了美洛昔康口服液對犬的安全性評價，首次劑量加倍，從第二天開始劑量減半，每天一次，連用5 d，給藥后第7 d與其第6 d的測定結果相比，無論是生理指標中的紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)，還是生化指標中的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和總蛋白(TP)的測定結果均在試驗犬的正常生理范圍內(nèi)，且與對照組相比，差異均不顯著。

本研究表明，美洛昔康片按推薦劑量使用，對靶動物犬是安全的。