黃明明, 喬維維, 章建浩,*, 王佳媚,2,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心/國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 210095;2.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

牛肉富含蛋白質(zhì)、碳水化合物以及礦物質(zhì),其氨基酸模式與人體相近,具有很高的生物價。在合適的環(huán)境條件下,微生物以牛肉為溫床生長繁殖,造成牛肉中病原體和毒素的積累以及肉品的腐敗變質(zhì),對肉品色澤、氣味、表觀質(zhì)構(gòu)以及食用安全方面造成不可逆的不利影響。因此在生產(chǎn)、加工、運輸和銷售過程中肉制品的交叉感染等安全問題成為消費者和生產(chǎn)者關(guān)注的焦點。

生物胺是一類由氨基酸脫羧或脫醛和酮氨基化而形成的含氮脂肪族、芳香族或雜環(huán)類低分子量有機化合物的總稱[1]。過量攝入生物胺會引起頭疼、惡心、心悸、血壓變化和呼吸紊亂等過敏反應(yīng)[2]。傳統(tǒng)的冷藏技術(shù)和氣調(diào)保鮮技術(shù)雖然可以有效地延長肉制品的貯藏期但無法達到有效殺菌和解毒的目的,其他冷殺菌技術(shù)存在設(shè)備成本過高、殺菌效率差及消費者接受度低等問題[3-4]。等離子體是指在高電壓作用下,中性氣體分子離解產(chǎn)生的正負電荷總量相等的離子、電子、自由基以及亞穩(wěn)態(tài)粒子。等離子體冷殺菌技術(shù)是在大氣壓條件下產(chǎn)生的處理溫度不超過室溫的非平衡等離子體,在等離子體腔室中產(chǎn)生的活性氧及活性氮自由基、亞穩(wěn)態(tài)粒子、紫外光子和電場都具很強的殺菌效果。研究發(fā)現(xiàn),活性氧、活性氮自由基可以有效地造成生物大分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì))的氧化變性,紫外照射可以引起DNA結(jié)構(gòu)的變化,多種等離子體活性物質(zhì)共同協(xié)同作用造成微生物的快速死亡,達到殺菌保鮮的目的。在肉及肉制品的殺菌效果方面,已有研究報道,Kim等[5]采用低溫等離子體處理培根切片,具有很好的殺菌效果,培根的L值呈升高趨勢,但a值無顯著變化。Misra等[6]應(yīng)用氮氣源激發(fā)的等離子體處理豬肉,可以有效殺死并抑制微生物生長,并且在貯藏過程中豬肉顏色和pH值均未有顯著變化。

本文研究低溫等離子體冷殺菌(cold plasma cold sterilization,CPCS)協(xié)同氣調(diào)保鮮技術(shù)(modified atmosphere packaging,MAP)處理對冷藏過程中牛肉主要微生物菌屬、揮發(fā)性鹽基氮含量、脂質(zhì)氧化以及主要生物胺含量的影響,分析CPCS協(xié)同MAP殺菌對牛肉品質(zhì)的影響,為低溫等離子體冷殺菌技術(shù)在生鮮牛肉保鮮包裝中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

牛背最長肌購于南京蘇果超市(衛(wèi)崗店),置于冰盒中運回實驗室備用;高氯酸、碳酸鉀、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、色胺(tryptamine,TRY)、苯乙胺(phenylethylamine,PHE)、尸胺(cadaverine,CAD)、腐胺(putrescine,PUT)、組胺(histamine,HIS)、酪胺(tyramine,TYR)、亞精胺(spermidine,SPD)、精胺(spermine,SPM),分析純,購于美國Sigma公司;微生物用培養(yǎng)基購于青島海博公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MAP-H360型復(fù)合氣調(diào)保鮮包裝機(配有氣體比例檢測裝置),蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司;低溫等離子體發(fā)生器(配有電壓調(diào)控箱,可控電壓0～90 kV),美國Phoenix公司;XC07-II型無菌拍打式均質(zhì)器,南京寧凱儀器有限公司;SJ-CJ-1D型超凈工作臺,蘇潔凈化儀器設(shè)備有限公司;SMIC型電熱滅菌鍋,上海申安醫(yī)用儀器廠;IKA T25型組織分散機(配有S25N-10G分散刀頭),德國艾卡儀器設(shè)備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(超聲頻率40KHz),昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方法

剔除原料肉表面筋膜,按照肌纖維的方向切成約50 g的肉塊,隨機分為2組,每組15塊,放入包裝盒(上海中央化工公司,透氧率=10 cm3/(m2·24 h))按照 V(O2)∶V(CO2)∶V(N2)=35% ∶35% ∶30% 的氣調(diào)比例進行氣調(diào)包裝,采用阻氧膜(美國Sealed Air公司,透氧率=25 cm3/(m2·24 h))熱封包裝。包裝樣品用CPCS處理,處理電壓72 kV,處理時間85 s。處理后的樣品置于4℃貯藏,在0、1、4、7、10 d時隨機抽取3盒測定相關(guān)指標(biāo)。氣調(diào)包裝組用MAP表示,CPCS協(xié)同氣調(diào)包裝組用CPCS+MAP表示。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法執(zhí)行。用滅菌剪刀將牛肉剪碎,稱取25 g牛肉放入225 mL滅菌生理鹽水中,均質(zhì)器2次/s拍打40 s,然后按10倍梯度稀釋到合適的稀釋度。每個稀釋度傾注3個平板,取平均值。各類微生物培養(yǎng)條件如表1。

表1 微生物培養(yǎng)條件Tab.1 Incubation conditions of microorganism

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮含量測定

揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVBN)的測定采用微量擴散法參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[7],并稍作修改。

1.3.4 硫代巴比妥酸值測定

準(zhǔn)確稱取5.00 g牛肉,加入20 mL蒸餾水和25 mLφ=20%三氯乙酸溶液,勻漿后靜置離心(5 000 r/min,10 min),過濾并定容至50 mL,吸取4.00 mL溶液加入4.00 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液,沸水浴加熱20 min使其形成粉紅色。冷卻,于532 nm測定吸光值?？瞻捉M：2.00 mLφ=7.5%含w=0.1%EDTA的三氯乙酸加入等體積的硫代巴比妥酸溶液。TBARs值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定,單位為mg MDA/kg。

1.3.5 生物胺的測定

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與柱前衍生

參照文獻[8]的方法并稍作改進。精確配制色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺8種生物胺的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL。 取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL,依次加入200μL 2 mol/L NaOH,300μL飽和NaHCO3溶液,2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液,40℃下避光反應(yīng)45 min,加入100μL 25%的氨水,靜置30 min,用乙腈定容至5 mL,過0.22μm的濾膜待測。

1.3.5.2 樣品處理

取牛肉5.00 g絞碎,加入 c=0.4 mol/L的HClO4溶液20 mL勻漿,然后使用超聲波提取儀提取30 min,于4℃條件下,以3 000 g離心10 min,取上清液,沉淀部分復(fù)溶后再提取一次。合并兩次上清液,使用c=0.4 mol/L的HClO4溶液定容至50 mL,從中取出1.00 mL的樣品溶液進行柱前衍生,方法同標(biāo)準(zhǔn)溶液的處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將所測得的生物胺含量以mg/kg肌肉表示,所有測定重復(fù)3次。

1.3.5.3 色譜條件

處理好的樣品采用高效液相色譜法進行測定,色譜儀為Waters 2690系統(tǒng)(Waters,Milford MA),色譜柱型號：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250 mm,5μm),254 nm紫外檢測,流速1 mL/min,進樣量20μL,柱溫35℃,流動相A為水,B為乙腈。梯度洗脫程序為0～5 minφA35%至30%;5～20 minφA30%至70%;20～24 min,φA0%;24～25 minφa0% 至 35%;25～30 min,φA35%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行方差分析,處理組和貯藏天數(shù)為固定因子,樣品為隨機因子進行一般線性模型分析,不同處理間差異顯著性采用 Duncan's多重比較分析,顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物含量的變化

牛肉經(jīng)CPCS協(xié)同MAP處理后在貯藏過程中主要微生物數(shù)量變化見表2,在貯藏過程中(1～10 d),CPCS+MAP處理組菌落總數(shù)及各類微生物含量顯著低于MAP處理組。在貯藏過程中CPCS+MAP處理組菌落總數(shù)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,在貯藏期第1天和第4天,菌落總數(shù)顯著低于第0天,這表明CPCS處理具有很好的殺菌效果。在貯藏期第10天,CPCS+MAP和MAP處理組菌落總數(shù)分別為5.76 lg(CFU/g)和7.46 lg(CFU/g),這表明CPCS處理在殺菌的同時還能達到抑菌的效果。

表2 牛肉貯藏過程中主要微生物含量變化Tab.2 Total colony counts of beef during storage lg(CFU/g)

貯藏過程中微生物菌屬變化如圖1。牛肉中主要微生物菌屬隨著貯藏時間延長,呈現(xiàn)出不同的增長狀況。由圖1可知,在貯藏初期假單胞菌含量最高,占菌落總數(shù)的39.8%。在貯藏期第10天,牛肉中優(yōu)勢菌由假單胞菌變?yōu)槿樗峋?在 MAP組和CPCS+MAP組中分別占菌落總數(shù)的60.3%和63.1%。在貯藏后期MAP處理組中各菌屬濃度大小依次為：乳酸菌、假單胞菌、熱殺索絲菌、微球菌和腸桿菌;在CPCS+MAP處理組中各菌屬濃度大小也是乳酸菌、假單胞菌、熱殺索絲菌、微球菌和腸桿菌。因此低溫等離子體處理對牛肉貯藏過程中菌屬的變化并無顯著作用。

圖1 貯藏過程中微生物菌屬變化Fig.1 Changes in microbial flora during storage

2.2 硫代巴比妥酸值的含量變化

硫代巴比妥酸值 (thiobarbituric acid values,TBARs)主要用于脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物被進一步氧化形成二次氧化程度的評判,代表脂質(zhì)氧化形成的丙二醛(malondialdehyde,MDA)等化合物的含量,一般用來衡量牛肉中脂質(zhì)的氧化程度。對貯藏中牛肉的TBARs值進行測量見圖2,可知隨著貯藏時間延長各處理組牛肉中TBARs含量均顯著上升(p＜0.05),在貯藏過程中CPCS+MAP處理組牛肉中的TBARs值始終顯著高于MAP對照組(p＜0.05)。

圖2 牛肉儲藏期間硫代巴比妥酸含量變化Fig.2 TBARs contents of beef during storage

研究人員認為肉制品中硫代巴比妥酸值含量超過1.0 mg MDA/kg時會產(chǎn)生酸敗的味道[9],但也有人員發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)論,研究發(fā)現(xiàn)牛肉中TBARs值在(0.5～2.0)mg MDA/kg范圍內(nèi)都是可接受范圍,在不超過2.0 mg MDA/kg范圍內(nèi)都是沒有酸敗氣味的[10]。低溫等離子體以氧氣為誘導(dǎo)氣體可產(chǎn)生大量的活性氧自由基,活性氧自由基的強氧化性可以迅速造成脂質(zhì)的氧化,使貯藏前期TBARs值升高,在貯藏過程中包裝盒中的氧氣與部分脂質(zhì)自由基反應(yīng)引起鄰近不飽和脂肪酸發(fā)生脫氫反應(yīng)-脂質(zhì)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),從而造成在貯藏過程中TBARs值的升高。相似的結(jié)果已有報道,MAP處理會造成牛肉儲藏期間脂質(zhì)氧化程度的提高,并且隨著氣體中 O2濃度的提高而提高[11]。也有部分研究發(fā)現(xiàn),低溫等離子體處理僅會造成牛肉在貯藏前期的脂質(zhì)氧化(p＜0.05),隨著貯藏的進行,低溫等離子體處理和對照組差異不再顯著[12],說明等離子體促進脂質(zhì)氧化只是在短時間起作用,隨著貯藏時間延長,促進作用減弱,這與等離子體中的活性成分壽命短有關(guān)系。

2.3 揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

圖3 貯藏過程中牛肉揮發(fā)性鹽基氮含量變化Fig.3 TVB-N contents of beef during storage

TVB-N是指蛋白質(zhì)在微生物分解作用下產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)與有機酸反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物,主要包括氨、二甲胺和三甲胺等。肉制品在貯藏過程中由于微生物的脫羧、脫氨基等作用,產(chǎn)生大量的游離氨基酸以及揮發(fā)性鹽基氮等物質(zhì),從而造成肉品質(zhì)的腐敗、酸敗。按照GB 2707—2005《鮮(凍)畜肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》,鮮肉中揮發(fā)性鹽基氮含量小于15 mg/100 g。對貯藏過程中牛肉的揮發(fā)性鹽基氮含量進行測定見圖3。隨貯藏時間延長,各實驗組牛肉的TVB-N含量增加顯著(p＜0.05),等離子體處理組的TVB-N值一直低于MAP處理組,但差異不顯著,到貯藏期第7天,兩者之間的差異達到最大值(1.51 mg/100 g)。在貯藏期第10天,CPCS+MAP處理組與MAP處理組的TVB-N值分別達到為15.02 mg/100 g和15.16 mg/100 g,超過國標(biāo)中的限量標(biāo)準(zhǔn)。TVB-N與微生物含量關(guān)系緊密,CPCS能殺死并抑制牛肉中微生物的生長繁殖,從而使得牛肉中TVB-N含量的下降。TVB-N為指標(biāo)判定牛肉新鮮度的效果滯后于菌落總數(shù),可能是因所測定的部分含氮化合物來源于微生物生長,微生物利用蛋白質(zhì)等作為生長基質(zhì),生成帶有異味的含硫化合物和胺類[13]。在貯藏期間,由于微生物受到低溫等離子體的抑制生長緩慢,產(chǎn)生含氮物的速率相對較低。

2.4 貯藏期間牛肉生物胺含量的變化

將 0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 mol/L 的 8 種混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進樣,根據(jù)濃度和對應(yīng)的峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程。對貯藏過程中牛肉的生物胺含量進行測定見表3。

表3 貯藏期牛肉中生物胺的含量變化Tab.3 Biogenic amines contents of beef during storage mg/kg

由表3可知,原料肉中共檢測到5種生物胺,其中精胺為牛肉中主要的生物胺,腐胺、組胺、亞精胺和苯乙胺的含量依次降低。在貯藏過程中,精胺的含量始終高于另外4種生物胺含量(p＜0.05)。精胺是天然存在于肉制品中的胺類物質(zhì),貯藏末期,精胺由于被微生物作為氮源利用[14],導(dǎo)致含量呈現(xiàn)顯著下降(p＜0.05)。經(jīng)等離子體處理的牛肉中精胺含量始終顯著低于MAP處理組(p＜0.05),10 d后,處理組的精胺含量低于未處理組4.37 mg/kg,表明低溫等離子體處理有效抑制牛肉中精胺含量增加。

腐胺含量僅次于精胺,隨貯藏時間延長,其含量顯著增加(p＜0.05),等離子體處理組牛肉腐胺含量顯著低于未處理組(p＜0.05),第4天時,處理組牛肉中腐胺含量低于MAP處理組1.16 mg/kg,兩組間的差異最大,之后兩組間的差異逐漸減少,表明低溫等離子體處理對牛肉中腐胺含量的抑制作用隨著貯藏時間延長而逐漸減弱。腐胺自身的毒性強弱受關(guān)注度相對低,而其對組胺毒性的增強作用受到廣泛關(guān)注,因其對組胺代謝酶活性具有明顯抑制作用[15]。此外,腐胺可以與亞硝酸鹽反應(yīng),作為亞硝胺形成的底物,有利于亞硝胺含量增加。

組胺含量隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。低溫等離子體處理組樣品中組胺含量始終低于MAP處理組,在4d時,兩組樣品間的差異最大。在貯藏期第10天,等離子體處理組牛肉中的組胺含量與初始原料中含量相同,表明等離子體處理對組胺的形成具有很好的抑制作用。亞精胺含量非常低,在貯藏過程中CPCS+MAP組與MAP組差異不顯著。貯藏結(jié)束,亞精胺含量是相同條件下5種生物胺含量最低的。

苯乙胺是原料肉中含量最低的生物胺類,其含量隨著貯藏時間的延長而顯著增加(p＜0.05)。苯乙胺含量隨著貯藏時間延長而顯著增加(p＜0.05),其變化規(guī)律與腐胺相同。苯乙胺是原料肉中含量最低的,而冷藏結(jié)束后,其含量超過同條件下亞精胺含量,表明低溫等離子體對牛肉中苯乙胺的抑制作用低于對亞精胺的作用。

牛肉冷藏過程中生物胺的形成主要是由氨基酸通過脫羧反應(yīng)而成,與此反應(yīng)相關(guān)的氨基酸脫羧酶活性與肉中腐敗微生物生長繁殖有關(guān),例如乳酸菌、腸桿菌和假單胞菌的生長繁殖都可能會影響氨基酸脫羧酶的活性。有效的殺菌處理可以殺滅或者是抑制牛肉中微生物生長繁殖,通過抑制牛肉中微生物的生長繁殖,可以控制肉中生物胺的形成。本研究中低溫等離子體可以有效抑制牛肉中微生物的生長繁殖,同時也抑制精胺、腐胺、組胺、亞精胺和苯乙胺的含量增加,表明低溫等離子體處理對牛肉的安全性具有很好的維持作用。

3 結(jié) 論

新鮮牛肉氣調(diào)包裝后經(jīng)過低溫等離子體處理,在4℃條件下貯藏10 d。研究低溫等離子體對貯藏過程中生鮮牛肉主要腐敗菌、硫代巴比妥酸、揮發(fā)性鹽基氮及生物胺的影響。在貯藏過程中低溫等離子體處理組牛肉中菌落總數(shù)、假單胞菌、熱殺索絲菌、乳酸菌、微球菌和腸桿菌的菌落含量均顯著低于氣調(diào)包裝組。10 d后,低溫等離子體處理組的菌落總數(shù)含量為5.76 lg(CFU/g),按照國標(biāo)屬于二級鮮度,此時而僅氣調(diào)包裝組牛肉中菌落總數(shù)含量超過國標(biāo)要求,因此,低溫等離子體處理可以有效延長牛肉的貨架期。雖然低溫等離子體處理造成牛肉中TBARs值的升高,但在(0～2)mg MDA/kg范圍內(nèi),一般認為TBARs含量低于2 mg MDA/kg時未對產(chǎn)品的風(fēng)味造成顯著影響。進過等離子體處理可以有效降低貯藏期間牛肉中TVB-N含量,從而達到保鮮的目的。經(jīng)低溫等離子體處理的牛肉中各種生物胺含量都明顯低于MAP處理組。本研究結(jié)果表明低溫等離子體處理能夠抑制牛肉中微生物生長繁殖,維持牛肉安全品質(zhì),因此,低溫等離子體冷殺菌對牛肉保鮮包裝中具有良好的應(yīng)用前景。