劉桂東

【摘要】建立適合本公司注射劑使用的藥用輔料枸櫞酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

【關(guān)鍵詞】枸櫞酸 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 干擾試驗(yàn)

方法：依照《中國藥典》2015年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法試驗(yàn)和結(jié)果判斷，采用pH調(diào)節(jié)法進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié)果：以湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的市售稀釋劑Ⅱ?qū)?gòu)椽酸原液進(jìn)行稀釋，對鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)最大不產(chǎn)生干擾的濃度為0.25mg·ml-1，使用0.O6EU·ml-1或靈敏度更高的賞鱟劑可對其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

結(jié)論：本細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法多次試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，可用于其質(zhì)量控制。

枸櫞酸又名檸檬酸，是一種重要的藥用輔料，其易溶于水，常溫下為無色晶體。藥典四1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法供試品溶液的制備中規(guī)定，必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。常用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋法和堿性試劑中和法，前者稀釋步驟較多，后者每次進(jìn)行試驗(yàn)均需要進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，耗時(shí)較長。故而本文采用稀釋劑Ⅱ進(jìn)行稀釋和調(diào)節(jié)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

枸櫞酸（湖南華日制藥有限公司，批號20180407，20180408，20180409）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE）；鱟試劑（TAL，批號1610311，0.25EU·ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批號1801153，0.06EU·ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批號1802207，0.O6EU·ml-1，湛江博康海洋生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，湛江安度斯生物有限公司）；稀釋劑Ⅱ（批號1709120，4ml·Amp-1，湛江安度斯生物有限公司）。

二、方法與結(jié)果

（1）細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定L=0.5EU·mg-1。

（2）鱟試劑靈敏度復(fù)核參照藥典方法，進(jìn)行鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。三種鱟試劑的靈敏度均在0.5λ～2λ之間，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

（3）干擾預(yù)試驗(yàn)?？紤]到現(xiàn)有鱟試劑分別為0.25，0.125，0.06和0.03EU·ml-1四個靈敏度。依據(jù)公式MVC=λ/L，有效稀釋濃度為0.5～0.0625mg·ml-1。選取靈敏度為0.25EU·ml-1的鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)。將20180407批的枸櫞酸以BET水溶解，制成10mg·ml-1的原液。以稀釋劑Ⅱ?qū)ζ湎♂?，使其終濃度分別為1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·ml-1，將濃度為0.5，0.25，0.125，0.0625mg·ml-1系列溶液記為NPC；同時(shí)在濃度為1，0.5，0.25，0.125mg·ml-1溶液中添加等體積4λ濃度的內(nèi)毒素溶液，使每一濃度試驗(yàn)液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，將此系列溶液記為PPC。取靈敏度為0.25EU·ml-1的TAL分別與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)做2管。結(jié)果表明，枸櫞酸的最高不干擾濃度為0.25mg·ml-1。

（4）正式干擾試驗(yàn)依據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.125mg·ml-1為樣品的不干擾濃度，選擇0.06EU·ml-1的TAL進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。以稀釋劑Ⅱ?qū)㈣蹤此嵩悍謩e稀釋至終濃度為0.25mg·ml-1和0.125mg·ml-1，以0.125mg·ml-1溶液作為供試品對照液，試驗(yàn)重復(fù)2管。用0.25mg·ml-1的枸櫞酸溶液將WSE配成濃度為2λ，λ，0.5λ和0.25λ四個系列濃度，試驗(yàn)重復(fù)4管。用BET水將WSE配成2λ，λ，0.5λ和0.25λ四個系列濃度，試驗(yàn)重復(fù)2管。同時(shí)以BET水為陰性對照，試驗(yàn)重復(fù)2管。用靈敏度為0.O6EU·ml-1的TAL進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)供試品對照液和陰性對照均為陰性時(shí)，結(jié)果按公式Es=1g-1（∑Xs/4）和Et=1g-1（∑Xt/4）計(jì)算，其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。干擾試驗(yàn)結(jié)果見表1和2。

結(jié)果表明，陰性對照為陰性且Es在0.5λ～2λ之間，試驗(yàn)有效。Et在0.5λ～2λ之間，符合規(guī)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖佳音，李慶忠，陳志勇.注射用藥用輔料枸櫞酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2013.

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