劉松年，荊凌華，伍 星，王俊紅

(河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診科，河南 洛陽 471003)

Hey基因?qū)儆趬A性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子超家族，具有bHLH結(jié)構(gòu)域、Orange結(jié)構(gòu)域和C末端的YRPW保守四肽。哺乳動物的Hey基因通常作為Notch信號通路的靶基因，參與心血管系統(tǒng)形成、神經(jīng)發(fā)生、骨骼和骨骼肌發(fā)育等[1]。Hey2基因敲除小鼠出現(xiàn)明顯的心血管缺損畸形[1]；Hey1基因高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和侵襲相關(guān)[2]。作為哺乳動物Hey基因相對應(yīng)的同源基因，果蠅Hey基因的功能尚未系統(tǒng)研究[3]。序列比對分析表明，果蠅Hey與哺乳動物Hey的bHLH結(jié)構(gòu)域具有97%的序列相似性；因此，研究果蠅Hey基因的功能和調(diào)控將為哺乳動物Hey基因的相關(guān)研究提供重要參考。本研究表達(dá)并純化Hey-His融合蛋白，進(jìn)而免疫新西蘭大白兔制備抗Hey抗體，為進(jìn)一步研究Hey基因在發(fā)育中的功能和調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料:W1118果蠅和pET28a載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)。Trizol試劑(Invitrogen公司)；cDNA合成試劑盒、高保真PCR擴(kuò)增試劑盒、限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)；BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(CWBIO公司)；Ni-IDA親和純化試劑盒、Protein A親和純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(Sangon公司)；弗氏免疫佐劑(Sigma公司)。SPF級雌性2.3 kg新西蘭大白兔(河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，批號160603)。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-Hey重組質(zhì)粒的構(gòu)建:按照Trizol試劑的說明書提取W1118果蠅胚胎的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性，Nanodrop檢測其濃度和純度。以質(zhì)檢合格的RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；然后以cDNA合成反應(yīng)液作為模板，PCR擴(kuò)增Hey基因的編碼序列；兩端分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。正向引物為：5′-GCCG AATTCATGGATCACAACATG-3′；反向引物為： 5′-TAACTC GAGTCAATAGGCCATCTC-3′(GENEWIZ公司)。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 8 min。

pET28a載體和PCR產(chǎn)物分別用EcoRⅠ和XhoⅠ于37 ℃酶切2 h，凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。純化產(chǎn)物在T4連接酶作用下20 ℃連接4 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂板培養(yǎng)。提取陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，經(jīng)過酶切驗(yàn)證后送至TaKaRa公司進(jìn)行測序。

1.2.2 Hey-His融合蛋白的表達(dá)與純化:將pET28a-Hey重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃過夜培養(yǎng)。然后將菌液以1∶100轉(zhuǎn)種至1 L培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)A值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心收集菌體并用PBS懸浮，超聲裂解后離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定，并按照Ni-IDA親和純化試劑盒的說明變性條件下純化融合蛋白。

1.2.3 抗體制備與特性檢測：將純化的融合蛋白常規(guī)免疫1只新西蘭大白兔。初次免疫于背部皮下多點(diǎn)注射；第21、35和49天分別加強(qiáng)免疫。第59天頸動脈取血，離心分離血清。按照Protein A親和純化試劑盒的說明純化抗血清。將融合蛋白包被微孔板后，采用間接ELISA檢測抗體效價(jià)。提取W1118果蠅胚胎的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜封閉后，依次加入抗Hey多抗(1∶1 000)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)，DAB顯色，以檢測抗體特異性。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-Hey重組質(zhì)粒構(gòu)建:本次實(shí)驗(yàn)所提取的總RNA濃度為258 ng/μL，A260/A280為2.03；瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，18 S條帶寬而亮，無拖尾和彌散等，表明RNA是完整的，純度符合標(biāo)準(zhǔn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后顯示，在約1 300 bp位置出現(xiàn)

特異性條帶。重組質(zhì)粒酶切分析結(jié)果(圖1)顯示，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到1 296 bp的目的片段，對陽性質(zhì)粒進(jìn)一步測序未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變和移碼突變。

M.DNA marker; 1.EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ digestion; 2.Xho Ⅰ digestion圖1 pET28a-Hey重組質(zhì)粒的酶切分析Fig 1 Enzyme digestion analysis of pET28a-Hey recombinant plasmid

2.2 Hey-His融合蛋白的表達(dá)與純化:IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約49 ku位置出現(xiàn)特異的目的條帶，未加IPTG的菌液沒有發(fā)現(xiàn)該條帶，表明Hey-His融合蛋白在誘導(dǎo)后有表達(dá)，且主要以包涵體形式存在。純化融合蛋白的SDS-PAGE顯示，在約49 ku位置有明顯條帶(圖2A)，灰度分析表明其純度為89.1%，測量濃度為1.3 mg/mL。

2.3 抗體制備與特性檢測結(jié)果:間接ELISA檢測抗體的效價(jià)為1∶256 000。利用該抗體對果蠅胚胎的總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在約47 ku位置出現(xiàn)特異性條帶，用免疫前血清檢測時(shí)沒有觀察到該條帶(圖2B)。

3 討論

果蠅Hey基因是根據(jù)小鼠Hey1基因的序列，通過檢索表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫而鑒定出來。原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)果蠅Hey基因的mRNA從胚胎期Stage 10開始出現(xiàn)，主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦和腹部神經(jīng)索；免疫染色表明Hey蛋白主要表達(dá)于有絲分裂后的新生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。初步的功能分析發(fā)現(xiàn)，果蠅Hey作為Notch信號的靶基因參與神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞的不對稱分裂，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[3]。前期本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了UAS-Hey轉(zhuǎn)基因果蠅品系，與GAL4品系雜交引起Hey基因過量表達(dá)，并出現(xiàn)異位剛毛等異常表型，表明Hey基因可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了pET28a-Hey重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，以選擇最佳的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件，最后確定IPTG終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)4 h。表達(dá)的Hey-His融合蛋白主要存在于包涵體中，在變性條件下(6 mol/L鹽酸胍和8 mol/L尿素)，經(jīng)Ni-IDA瓊脂糖層析柱純化。純化后Hey-His融合蛋白的純度為89.1%，滿足后續(xù)免疫對抗原的要求。另外His標(biāo)簽非常小，免疫原性也相對較低，對目的蛋白自身特性幾乎沒有影響，不會改變目的蛋白的可溶性、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。間接ELISA和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)制備的抗體具有很高的效價(jià)和良好的特異性。采用制備的抗體進(jìn)行Western blot發(fā)現(xiàn)果蠅胚胎組織中Hey蛋白高表達(dá)，提示Hey蛋白在果蠅胚胎發(fā)育過程行使關(guān)鍵功能。

A.the expression and purification of Hey-His fusion protein; M.protein marker; 1.total protein of BL21(DE3) without induction; 2.total protein of BL21(DE3) with IPTG induction; 3.the purified fusion protein; B:specificity analysis of anti-Hey antibody by Western blot, M.protein marker, 1.anti-Hey antibody, 2.preimmune serum圖2 Hey-His融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和抗Hey抗體的特異性分析Fig 2 The expressed Hey-His fusion protein with induction and specificity analysis of anti- Hey antibody

總之，抗Hey蛋白抗體的成功制備為應(yīng)用免疫染色、免疫共沉淀等方法進(jìn)一步研究Hey基因在發(fā)育過程中的功能及調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，也對哺乳動物Hey基因的相關(guān)研究提供參考和借鑒。