涂其武，沈曉黎

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 江西 南昌 330000)

惡性腦腫瘤(主要為神經(jīng)膠質(zhì)瘤)占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%。近20年來，膠質(zhì)瘤患者的中位生存期無明顯改善，以各種療法均難以達到根治程度，幾乎毫無例外地遲早要復(fù)發(fā)[1]。最近幾年，細胞分子機制的深入研究成為有效治療腫瘤的關(guān)鍵。自1993年發(fā)現(xiàn)miRNAs，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1 000多種miRNAs。miR- 34家族為近年來備受關(guān)注的miRNA之一，miR- 34a是其中一種且其作用機制已經(jīng)明確[2]。目前已有研究證實，腫瘤細胞內(nèi)miR- 34a的表達異常與細胞增殖及凋亡相關(guān)。在神經(jīng)母細胞瘤中，染色體1p的雜合缺失導(dǎo)致miR- 34a表達減少，進而引起腫瘤異常增殖及侵襲能力減弱[3]。另外，miR- 34a可以通過AKT和Wnt信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖[4]。

目前研究證實，在許多腫瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)都呈高表達，與腫瘤侵襲遷移密切相關(guān)，且是Wnt信號通路下游靶基因[5- 6]。在預(yù)測miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)MMP2是miR- 34a潛在的靶基因。MMP2與miR- 34a在腦膠質(zhì)瘤細胞中侵襲和遷移的研究未見報道，其機制尚不清楚。本研究中，為了證實miR- 34a是否通過MMP2影響腦膠質(zhì)瘤細胞的生物學(xué)功能，檢測腦膠質(zhì)瘤細胞株中miR- 34a及MMP2的表達情況，并且觀察miR- 34a及MMP2對腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

腦膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172、U251、U373、 U87及人正常腦膠質(zhì)細胞(HEB)(ATCC公司)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液(Gibco 公司)；LipofectamineTMLTX and Plus Reagent(3000) 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen 公司)； Trizol(RNA提取試劑盒)、PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(大連寶生物工程有限公司);一步法RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(TaKaRa公司)；microRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；鼠抗人MMP2和兔抗人微管蛋白(Tubulin)抗體(武漢三鷹公司)；山羊抗兔IgG(二抗)和山羊抗鼠IgG(二抗)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Western blot曝光化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；pcDNA5和PGL3質(zhì)粒載體，雙熒光素酶報告基因試劑盒(Promega公司)；限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶、XhoⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、pyrobest DNA聚合酶、DpnⅠ酶、大量質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒；設(shè)計的miR- 34a、MMP2等DNA序列，miR- 34a、RNU6B、MMP2、GAPDH熒光定量相關(guān)引物、MMP2 3′UTR區(qū)野生型及突變型的熒光素酶質(zhì)粒(上海生工公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細胞及HEB，傳代培養(yǎng)使用含10% 胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液。篩選MMP2相對高表達的細胞株后，按新型脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX and Plus Reagent(3000)轉(zhuǎn)染試劑說明書用DMEM培養(yǎng)液進行轉(zhuǎn)染，設(shè)置空白對照組同時分別轉(zhuǎn)染miR- 34a mimic和抑制劑， 6 h 后換含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，待質(zhì)粒高表達后提取細胞RNA和總蛋白。在pcDNA5-miR- 34a與PGL3-MMP2 3′UTR-WT或PGL3-MMP2 3′UTR-mut共轉(zhuǎn)染和分別轉(zhuǎn)染pcDNA5-miR- 34a及pcDNA5-MMP2時，方法同上。

1.2.2 設(shè)計引物及構(gòu)建pcDNA5-miR-34a、pcDNA5-MMP2質(zhì)粒：根據(jù)GenBank的基因序列設(shè)計引物如下：miR- 34a上游引物5′-TGGCAGTGTCTTAGCTG GTTGT-3′,下游引物5′-AACCAGCTAAGACACTGCC ATT-3′；RNU6B上游引物5′-TCGCTTCGGCAGCAC-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′；MMP2上游引物5′-AGAAGGCTGTGTTCTTCGCA-3′,下游引物5′-AAAGGCAGCGTCTACTTGCT-3′；GAPDH上游引物5′-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3′,下游引物5′-GTTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′。用T4 DNA連接酶連接miR- 34a全長片段與pcDNA5空載體，MMP2全長片段與pcDNA5載體鏈接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌，擴增后大量抽提質(zhì)粒DNA，酶切及測序驗證。

1.2.3 microRNA靶基因的預(yù)測：使用TargetScan(http://www.targetscan.org)、Pictar(http：//pictar.mdcberlin.de)、microRNA(http://www.microrna.org)和miRecord(mirecords.biolead.org)4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR- 34a與MMP2的結(jié)合區(qū)域。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因：將預(yù)測的與成熟miR- 34a mRNA結(jié)合的MMP2 mRNA 3′UTR區(qū)域野生型及突變型的特定序列克隆整合到PGL3-promoter-vector載體里，構(gòu)建出PGL3-MMP2 3′UTR-WT和PGL3-MMP2 3′UTR-mut兩個質(zhì)粒。具體按雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作。

1.2.5 RT-qPCR 法檢測各基因的mRNA表達水平;用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，按PCR試劑盒說明書操作。在ABI 7300實時熒光定量機器上PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。以2—ΔΔCt值表示各基因 mRNA 的相對表達水平。

1.2.6 Western blot、Transwell侵襲實驗和劃痕實驗：其步驟方法參考相關(guān)文獻[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 在多株腦膠質(zhì)瘤細胞株里miR- 34a和MMP2的表達情況

MMP2的蛋白含量在各腦膠質(zhì)瘤細胞株內(nèi)呈高表達，其中U87和A172相對高表達(P<0.05)(圖1A)。MMP2的mRNA呈高表達，而miR- 34a的mRNA水平相對呈低表達(P<0.01)(圖1B)。

2.2 在U87和A172細胞株內(nèi)miR- 34a可以下調(diào)MMP2的蛋白及mRNA水平

選用MMP2表達高的U87和A172細胞，轉(zhuǎn)染miR- 34a mimic及抑制劑后，明確過表達及抑制有效果(圖2A)，轉(zhuǎn)染mimic的細胞株內(nèi)MMP2的蛋白及mRNA水平相對空白對照組均下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)染抑制劑的細胞株內(nèi)MMP2的表達均上升(P<0.05)(圖2B，C)。

2.3 miR-34a通過結(jié)合MMP2 mRNA 3′UTR區(qū)特定序列下調(diào)MMP2的表達

將野生型的MMP2 3′UTR區(qū)與突變型的MMP2 3′UTR區(qū)的熒光素酶質(zhì)粒分別與pcDNA5-miR- 34a質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入U87和A172細胞，進行熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｒ吧蛯嶒灲M熒光素酶活性明顯下降(P<0.05)(圖3)。

2.4 miR- 34a通過調(diào)控MMP2進而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲遷移

在U87細胞株內(nèi)分成3組，空白對照組、MMP2過表達組、miR- 34a 和MMP2過表達組。過表達MMP2組細胞侵襲遷移能力增強，但是miR- 34a 和MMP2過表達組的侵襲遷移能力下降(圖4)(表1)。

3 討論

惡性腦腫瘤的綜合治療將不再是傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和細胞毒化療，正在飛速發(fā)展的分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)提供了解決這一難題的有力武器。腫瘤細胞侵襲遷移的能力直接影響了腫瘤細胞的擴散，導(dǎo)致腫瘤治療的難度增加，降低患者的術(shù)后放化療療效[8]。目前許多研究已經(jīng)證實MMP2參與了腫瘤細胞的侵襲遷移， 在腦膠質(zhì)瘤、 結(jié)腸癌、 胰腺癌和肺癌中都有類似報道[7,9]。MMP2表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈負相關(guān)，暗示MMP2是個癌基因在腦膠質(zhì)瘤中[10]。另外，miR- 34a 可以通過靶向結(jié)合Bcl- 2參抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和促進腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡[11]。因此，推測可能miR- 34a和MMP2都與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。

miR- 34a在許多惡性腫瘤內(nèi)低表達。在60例腦膠質(zhì)瘤患者臨床術(shù)后標(biāo)本和A172細胞株中發(fā)現(xiàn)miR- 34a低表達[12]，這與本研究中檢測的多株腦膠質(zhì)瘤細胞株中miR- 34a表達情況一致。在U87細胞株中研究miR- 34a通過調(diào)控Dll- 2的表達影響U87細胞株的生物學(xué)功能[13]。在本研究中選用了U87和A172細胞株進行研究。MMP2參與了許多惡性腫瘤的侵襲遷移，其成為腫瘤靶向治療的一個新的靶點。在U87細胞株內(nèi)p53可以通過MMP2增加侵襲能力[9]，而檢測了45例兒童腦膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)MMP2呈高表達[14]，這與MMP2抑制腦膠質(zhì)瘤的侵襲遷移報道一致。所以將miR- 34a與MMP2結(jié)合起來研究對腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)功能影響的機制。miR- 34a可以通過結(jié)合MMP2 3′UTR區(qū)域抑制腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲遷移，這與目前大多數(shù)研究報道m(xù)iR- 34a在腫瘤里低表達是抑癌基因的結(jié)果一致。

A.Western blot analysis of MMP2 expression in HEB cell and cancer cell lines；B.RT-qPCR analysis of miR- 34a and MMP2 expression in HEB,U251,A172, U373 and U87 cell lines;*P<0.05,**P<0.01 compared with HEB

A.RT-qPCR was performed to confirm the transfection efficiency of miR- 34a mimic and inhibitor in U87 cells；B.miR- 34a downregulated MMP2 protein level in U87 and A172 cells；C.miR- 34a downregulated Notch1 mRNA expression in U87 and A172 cells;*P<0.05 compared with control

A.Human MMP2- 3′UTR binding site for miR- 34a，and mutant MMP2- 3′UTR；B.miR- 34a significantly suppressed the luciferase activity of Wt MMP2- 3′UTR reporter gene, but not the Mt MMP2- 3′UTR；*P< 0.05 compared with the control

圖3 miR- 34a通過結(jié)合MMP2 mRNA 3′UTR來下調(diào)MMP2的表達 Fig 3 miR- 34a downregulated MMP2 by binding to the mRNA n=3)

*Compared with control,using scheffe to perform multiple comparisons in the post-hoc.

A.the effect of invasive ability (crystal violet staining ×400); B.migration capacity (microscopy × 100)圖4 miR- 34a調(diào)節(jié)MMP2對腦膠質(zhì)瘤侵襲遷移能力的影響Fig 4 miR- 34a regulated MMP2 on invasion and metastasis of glioma cells n=3)

綜上所述，本研究在腦膠質(zhì)瘤中將miR- 34a與MMP2結(jié)合起來研究，而且報道證實miR- 34a結(jié)合MMP2 mRNA 3′UTR區(qū)的特定序列，進而抑制了腦膠質(zhì)瘤的細胞侵襲遷移，為腦膠質(zhì)瘤靶向治療提供了新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。