居冠軍，施民新*，陸海敏，毛清華，許 峰，汪志文，薛 群

(1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胸外科， 江蘇 南通 226361；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 胸外科， 江蘇 南通 226001)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，在許多國家，肺癌已經(jīng)是癌相關(guān)性死亡的最主要的原因[1]。SOX(SRY-like HMG box)是一類具有特征性HMG(hight mobility group, HMG)DNA結(jié)合區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子家族。作為癌基因，SOX2在多種癌組織包括胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和神經(jīng)內(nèi)分泌性癌表達(dá)增高并發(fā)揮促癌作用[2]。

羧基末端結(jié)合蛋白(COOH-terminal binding protein，CTBP)是由CTBP1基因和CTBP 2基因分別編碼產(chǎn)生的CTBP1和CTBP2兩種蛋白[3]。CTBP1在促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中有重要作用，并抑制黏附分子E-cadherin的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞間的黏附減少，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這點(diǎn)已在多種腫瘤中被證實(shí)[4]。在非小細(xì)胞肺癌中，CTBP1通過多種途徑參與到肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5-6]。然而目前的研究并未指出CTBP1促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本：本組非小細(xì)胞肺癌石蠟標(biāo)本114例及新鮮配對組織標(biāo)本，均由南通市腫瘤醫(yī)院提供。標(biāo)本來自2013年7月至2015年7月在南通市腫瘤醫(yī)院胸外科所實(shí)行的肺癌根治術(shù)，術(shù)前未行放化療。病理診斷明確，臨床病理資料完整。年齡39～77歲；肺癌直徑<3 cm 55例，≥3 cm 59例；組織學(xué)高分化13例，中分化76例，低分化25例；鱗癌54例，腺癌43例，其他類型癌17例。新鮮配對組織標(biāo)本8對，新鮮組織離體后凍存于液氮中，隨后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，以便提取組織蛋白。本研究經(jīng)南通市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，并取得所有涉及此項(xiàng)研究患者的知情同意。

1.1.2 細(xì)胞及試劑：人類肺癌細(xì)胞系H1299(中國科學(xué)院細(xì)胞庫上海保藏中心)；兔抗人SOX2、CTBP1、Snail多克隆抗體(Abgent公司)；兔抗人GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz公司)；Envision免疫組化檢測試劑盒(GBI公司)，含有Polymer Helper(即用型，試劑1)、HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG(即用型，試劑2)。本研究中所使用的siRNA由上海吉瑪基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western blot 檢測SOX2、CTBP1、Snail蛋白表達(dá)：按照蛋白裂解液說明書提取組織蛋白，測定蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻，沸水處理6 min，快速降至室溫后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濃縮膠濃度5%，恒壓80 V，分離膠濃度10%，恒壓120 V。分離膠上的蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫下封閉約2 h 后，加入一抗，4 ℃搖動孵育過夜。TBST 洗滌10 min×3次，加入二抗，室溫下孵育約2 h，注意全程避光，TBST 洗滌10 min×3次。最后電化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影。應(yīng)用Odyssey成像儀軟件分析蛋白條帶的吸光度值，以目的蛋白/GAPDH比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化檢測SOX2、CTBP1、E-鈣黏蛋白及波形蛋白的表達(dá)與分布情況：用Envision免疫組織化學(xué)染色方法觀察114例非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)本中SOX2、CTBP1、E-鈣黏蛋白及波形蛋白的表達(dá)與分布情況。CTBP1以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性，SOX2以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。對CTBP1和SOX2的染色評估采用半定量評分法。染色強(qiáng)度評分：0分(無著色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)。CTBP1陽性細(xì)胞率評分：0分(<10%)，1分(10%～30%)，2分(30%～50%)，3分(50%～70%)，4分(>70%)。SOX2陽性細(xì)胞率評分：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(25%～45%)，3分(45%～60%)，4分(>60%)。免疫反應(yīng)評分(IS)=陽性細(xì)胞率評分×染色強(qiáng)度評分。IS 0～4分為低表達(dá)組，IS 5～12分為高表達(dá)組。

1.2.3 免疫沉淀、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及劃痕實(shí)驗(yàn)：具體方法參考既往文獻(xiàn)描述[7-8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對不同類的肺癌之間的比較采用單因素方差分析，采用χ2檢驗(yàn)CTBP1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與患者相應(yīng)的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行。

1.4 吸光度值分析

通過電腦輔助圖像分析系統(tǒng)測定條帶的吸光值，并通過GAPDH對各蛋白的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對照組和實(shí)驗(yàn)組之間的相對差異進(jìn)行了計(jì)算。各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)了3次。

2 結(jié)果

2.1 SOX2及CTBP1在8對人NSCLC癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)

在NSCLC組織中SOX2與CTBP1的表達(dá)水平較相應(yīng)的癌旁組織高(P<0.05)(圖1)。

2.2 SOX2和CTBP1在人NSCLC組織及細(xì)胞中相互作用

SOX2和CTBP1在NSCLC組織和H1299細(xì)胞中存在相互作用(圖2)。

2.3 SOX2、CTBP1、E-鈣黏蛋白和波形蛋白在人NSCLC轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)

SOX2、CTBP1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)要高于癌旁的肺癌組織；與非轉(zhuǎn)移組相比，轉(zhuǎn)移組SOX2、CTBP1、vim的表達(dá)要高，而E-cad表達(dá)相對較低(圖3)。

N.paraneoplastic; T.tumor; *P<0.05 compared with paraneoplastic tissues圖1 SOX2與CTBP1在NSCLC癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of SOX2 and CTBP1 in NSCLC tissues and corresponding paraneoplastic n=8)

A.interaction between SOX2 and CTBP1 in H1299 cells； B.interaction between SOX2 and CTBP1 in fresh NSCLC tissues圖2 SOX2與CTBP1的相互作用Fig 2 Interaction between SOX2 and CTBP1

A.the non-metastasis group of lung adenocarcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were negative or weakly positive, E-cad was strongly positive, Vim positive;B.the metastasis group of lung adenocarcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were strongly positive, E-cad was negative, Vim strong positive; C.the non-metastases group of lung squamous cell carcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were negative, E-cad was positive, Vim positive; D.the metastases group of lung squamous cell carcinoma(×40, left; ×200, right),SOX2 and CTBP1 were strongly positive, E-cad was negative, Vim strong positive

圖3免疫組化檢測在轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌中SOX2和CTBP1的表達(dá)

Fig3ExpressionofSOX2，CTBP1inmetastaticandnon-metastaticNSCLCtissuesbyinmmunohistochemicalstain(×40，×200)

2.4 CTBP1表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CTBP1的表達(dá)水平與臨床分期(P<0.001)、組織分化程度(P<0.001)、SOX2表達(dá)(P<0.001)、Ki67表達(dá)相關(guān)(P<0.001)，CTBP1的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、吸煙情況之間沒有明顯關(guān)系。

2.5 SOX2與CTBP1相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制

在H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染CTBP1-shRNA-3的干擾效率最高。轉(zhuǎn)染到H1299細(xì)胞72 h，提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測CTBP1的表達(dá)降低，SOX2及其下游靶基因Snail的表達(dá)也降低(圖4)。

圖4 通過Western blot檢測干擾后CTBP1、SOX2及其下游靶基因Snail的表達(dá)Fig 4 Expression of CTBP1, SOX2 and its downstream target gene Snail in H1299 cells after interference by Western blot

2.6 通過干擾CTBP1的表達(dá)使肺癌細(xì)胞的遷移能力下降

shRNA干擾CTBP1的表達(dá)后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在H1299細(xì)胞中，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組H1299細(xì)胞體外遷移能力受到抑制(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group圖5 在H1299細(xì)胞中干擾CTBP1的表達(dá)能降低細(xì)胞的遷移能力Fig 5 Interfering with the expression of CTBP1 can reduce cell migration in H1299 cells

3 討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是讓腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要一環(huán)，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)上調(diào)，而上皮標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)下調(diào)[9]。EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail等過表達(dá)之后可促進(jìn)癌的轉(zhuǎn)移過程，表明EMT對癌轉(zhuǎn)移過程具有重要的調(diào)控作用[10]。本課題對SOX2和CTBP1的研究也是基于這一點(diǎn)。

在本研究中，首先發(fā)現(xiàn)在NSCLC細(xì)胞及組織中SOX2與CTBP1能形成復(fù)合物。免疫印跡檢測CTBP1及SOX2在腫瘤中是高表達(dá)的。其次，在114例石蠟切片中通過免疫組化檢測CTBP1的表達(dá)情況及其與臨床參數(shù)的關(guān)系，顯示SOX2和CTBP1在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移組中表達(dá)明顯比非轉(zhuǎn)移組高，與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vim的表達(dá)趨勢一致。CTBP1的表達(dá)水平與腫瘤組織分化程度、臨床分期、SOX2表達(dá)及Ki-67表達(dá)相關(guān)。此外，敲低CTBP1可明顯抑制SOX2的表達(dá)，并導(dǎo)致SOX2信號通路下游靶基因Snail的表達(dá)降低。最后，以siRNA干擾CTBP1的表達(dá)，通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的遷移能力有所下降。這樣的CTBP1-SOX2高表達(dá)存在方式可能是NSCLC發(fā)生發(fā)展的一種常見方式，進(jìn)而可能影響到NSCLC的生物學(xué)功能。

SOX2可通過EMT機(jī)制促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移[11]。進(jìn)一步對SOX2在腫瘤EMT的研究發(fā)現(xiàn)，SOX2能結(jié)合在Snail的啟動子區(qū)域，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，并且顯著地抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換和腫瘤的轉(zhuǎn)移[2]。SOX2的HMG區(qū)域可以作為潛在的蛋白伴侶分子的結(jié)合位點(diǎn)，以及SOX2的乙?；稽c(diǎn)，可以調(diào)節(jié)SOX2的出入核轉(zhuǎn)位、乙?；胺核鼗到?，當(dāng)SOX2乙酰化受阻時，SOX2不能出核被降解，在核內(nèi)持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)下游信號傳遞[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)CTBP1在低氧環(huán)境下能夠與其他蛋白質(zhì)形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，增強(qiáng)組蛋白脫乙酰基酶的活性，促進(jìn)組蛋白的去乙酰化[13]。因此推測，在腫瘤持續(xù)增殖所造成的局部微環(huán)境缺氧刺激下，CTBP1被誘導(dǎo)形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，與SOX2相互作用，促進(jìn)SOX2的去乙?；种破涑龊私到?，并持續(xù)激活下游靶基因Snail的表達(dá)，促進(jìn)肺癌的EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移。因此在下一步的研究中應(yīng)深入研究CTBP1調(diào)節(jié)SOX2的機(jī)制，進(jìn)一步驗(yàn)證SOX2和CTBP1的相互作用，對下游的影響以及對EMT的作用。