程 黎，楊 平

(重慶市急救醫(yī)療中心, 重慶 400010)

遏制早期過度和失控的炎性反應(yīng)被認為是控制急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1]。新近發(fā)現(xiàn)miR- 21可參與組織的炎性反應(yīng)調(diào)控。應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)炎性腸病患者中miR- 21表達增高，且與炎性活動密切相關(guān)[2- 3]；氣道炎性反應(yīng)小鼠中miR- 21亦呈高表達[4]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)基因是miR- 21的重要靶基因，干擾PDCD4表達后促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)產(chǎn)生增多，提示PDCD4有抗炎作用[5]。而烏司他丁(ulinastatin,UTI)可下調(diào)miR- 21表達發(fā)揮對深低溫體外循環(huán)ALI保護作用[6]。因此，推測UTI能通過下調(diào)miR- 21而增加肺部PDCD4的表達，減少炎性因子的釋放。

本研究旨在通過動物實驗探討miR- 21在ALI中的作用，并豐富對UTI減輕炎性反應(yīng)作用機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：40只SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，[重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證號：SCXK(渝)2012- 0001]，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑：LPS(Sigma公司)；UTI(廣東天普生化醫(yī)藥公司)；microRNA及總RNA提取試劑盒(Biotake公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及MiScriptⅡRT-qPCR SYBRGreen Kit(TaKaRa公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及Western blot配膠試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；髓過氧化物氧化酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(武漢基因美生物科技公司)；ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技公司)；兔來源多克隆β-actin抗體和HRP-羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)公司)；PDCD4多克隆抗體(BIOSS公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠按隨機數(shù)字表分為對照組(control group)、LPS組(LPS group)以及低和高劑量烏司他丁干預(yù)組(UTI-L group，UTI-H group)，每組10只。以3 mg/kg質(zhì)量經(jīng)插管氣道內(nèi)滴入LPS(1 μg/μL)建立ALI模型，建模即刻UTI按5×104U/kg和1×105U/kg腹腔內(nèi)注射給藥。

1.2.2 小鼠肺組織病理切片染色并觀察病理改變:造模后72 h，取右上肺組織，4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE)，光鏡觀察。

1.2.3 W/D值：小鼠肺濕干重比(W/D)造模后72 h，取肺組織稱重后置于60 ℃烤箱48 h至恒重，再稱重，計算W/D值。

1.2.4 MPO活性：小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)常規(guī)收集BALF 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，計數(shù)粒細胞、測定蛋白、IL- 1β、TNF-α含量和MPO活性。

1.2.5 Western blot測小鼠肺組織PDCD4的蛋白水平：按試劑盒要求提取小鼠肺組織蛋白，BCA法測所提取蛋白濃度，聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗PDCD4(1∶500)或β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP-羊抗兔二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL法顯像，Quantity One軟件分析條帶吸光度值。

1.2.6 qPCR測小鼠肺組織miR- 21及PDCD4 mRNA表達水平：按試劑盒說明書提取總RNA，按RNA PCR Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進行PCR擴增。miR- 21的上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAG ACTGATG-3′，下游引物為5′-CTTAACGGCTGAGGT GCTGT-3′；內(nèi)參U6的上游引物為5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，下游引物為5′-TGCGTTTAAGCACT TCGCAA-3′；PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。PDCD4的上游引物為5′-AACTATGATGACGACCAGGAGAAC-3′，下游引物為5′-CCACAACCGTCACAGGAATCG-3′；內(nèi)參GAPDH的上游引物為5′-AGGTTGTCTCCTGCGA CTTCA-3′，下游引物為5′-TCG TTGTCTCACCACCTG GAG-3′；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變

LPS組72 h可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔水腫增厚明顯；UTI-L組中等量炎性細胞浸潤，肺泡間隔水腫中度增厚； UTI-H組少量炎性細胞浸潤，肺泡間隔水腫輕度增厚(圖1)。

2.2 肺組織W/D值變化

與對照組比，LPS組72 h W/D值明顯增高(P<0.05)，UTI處理組W/D值較LPS組明顯降低(P<0.05)，且與UTI劑量相關(guān)(圖2)。

2.3 BALF的粒細胞計數(shù)、總蛋白含量、IL- 1β、TNF-α含量及MPO活性

與對照組比較，LPS組粒細胞計數(shù)顯著增高，同時伴總蛋白含量、IL- 1β、 TNF-α含量及MPO活性升高，UTI干預(yù)后粒細胞計數(shù)回落，總蛋白含量、炎性細胞因子及MPO活性降低， UTI的保護作用與其劑量密切相關(guān)(圖2)。

A.control group; B.LPS group; C.UTI-L group; D.UTI-H group圖1 各組小鼠肺組織病理改變Fig 1 Pathological changes in the lung tissues(×200)

2.4 UTI干預(yù)后對小鼠肺組織miR- 21和PDCD4表達的影響

與對照組比較，LPS組肺組織中miR- 21表達明顯增高，PDCD4蛋白水平明顯下降，UTI干預(yù)后miR- 21表達降低明顯，PDCD4蛋白水平顯著增高，且增高水平與UTI劑量相關(guān)，而PDCD4 mRNA在UTI干預(yù)前后無明顯變化(圖3)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group;△P<0.05 compared with UTI-L group

圖2肺組織濕/干重比及BALF中PMN計數(shù)、總蛋白含量、IL-1β、TNF-α含量和MPO活性測定

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with LPS group; △P<0.05 compared with UTI-L group圖3 肺組織中miR- 21、PDCD4 mRNA及PDCD4蛋白水平的測定

3 討論

ALI是臨床常見的危重癥之一，以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤、肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)肺水腫等多種急性炎性反應(yīng)相關(guān)的表現(xiàn)是其主要的病理學(xué)改變，自我放大失控的炎性反應(yīng)被認為是ALI發(fā)病中心環(huán)節(jié)。采用LPS復(fù)制ALI動物模型是較理想且常用的方法，本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組病理切片發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，評估肺水腫的指標(biāo)W/D值增高，BALF中PMN計數(shù)、蛋白及IL- 1β、TNF-α含量，MPO活性明顯增高，炎性反應(yīng)明顯，符合ALI時肺組織損傷的特點，是合格的動物模型。

UTI是一種抑酶譜廣泛的蛋白酶抑制劑，可抑制糖、脂質(zhì)水解酶及多種蛋白酶的活性，同時改善中性粒細胞及巨噬細胞導(dǎo)致的組織損傷[7- 8]。本實驗發(fā)現(xiàn)UTI干預(yù)后小鼠肺組織炎性反應(yīng)減輕、W/D值下降、BALF中PMN計數(shù)、蛋白及IL- 1β、TNF-α含量及MPO活性明顯降低，改善程度呈劑量相關(guān)性。與既往研究結(jié)果[9]一致，UTI可以減輕和抑制LPS導(dǎo)致的肺組織的炎性反應(yīng)。

近來研究發(fā)現(xiàn)miR- 21在調(diào)控免疫炎性反應(yīng)中有重要作用[10]，它可以減少對蛋白激酶B的抑制，進而減少對與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的NF-κB的抑制，促進炎性反應(yīng)[11]。實驗發(fā)現(xiàn)，ALI時肺部炎性反應(yīng)的加重伴隨著miR- 21水平增高，給予UTI干預(yù)后，ALI時肺組織炎性反應(yīng)改善的同時伴隨著miR- 21水平降低，且降低程度與UTI干預(yù)劑量密切相關(guān)，提示UTI對ALI肺炎性反應(yīng)保護作用可能是通過調(diào)控miR- 21發(fā)生的。

PDCD4是miR- 21調(diào)控的靶基因[12]，主要為轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控蛋白的表達。目前發(fā)現(xiàn)PDCD4同樣參與某些炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。在RAW264.7細胞系中，下調(diào)PDCD4可以促進LPS誘導(dǎo)的促炎細胞因子產(chǎn)生，提示PDCD4有抑炎作用[14]。實驗發(fā)現(xiàn)在不同劑量UTI干預(yù)后，miR- 21表達下調(diào)伴隨著其靶蛋白PDCD4含量增加。但PDCD4 mRNA的相對表達量卻無明顯變化，PDCD4 mRNA與蛋白表達不同步可能與miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的翻譯而不降解mRNA的調(diào)控機制有關(guān)[15]。

綜上所述，烏司他丁能下調(diào)miR- 21的表達，增加其靶蛋白PDCD4表達，從而發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)的ALI的炎性保護作用。本實驗不足之處是未深入研究烏司他丁調(diào)控miR- 21的具體機制。