陳曉依，王浩宇，呂 洋，王海萍*，孫 微，李 柔

(河北北方學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

近年來，由動(dòng)脈粥樣硬化引起的缺血性心臟病的發(fā)病率逐年增高。目前主要有介入治療和外科血運(yùn)重建等治療措施。這些措施能保護(hù)未受損的心肌細(xì)胞，但無法恢復(fù)梗死心肌細(xì)胞的功能。而干細(xì)胞移植為治療缺血性心臟病帶來了曙光。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)作為一種多能干細(xì)胞，由于取材容易，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，并具有多向分化潛能而備受重視[1]。

p53 特異性抑制劑 PFT-α(p-fifty three inhibitor-alpha, PFT-α)最早應(yīng)用于腫瘤藥物毒不良反應(yīng)的治療。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP- 2)是在心臟的形成過程當(dāng)中起重要作用的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)胚胎早期發(fā)育。本課題以PFT-α和BMP- 2聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌細(xì)胞分化為目的，比較其單獨(dú)及聯(lián)合誘導(dǎo)分化的效果，為干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供可參考性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)3周齡SD大鼠25 g，雄性(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)為：11401300053540)[2]。IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶等(Gibco公司)；PFT-α和BMP- 2(Sigma公司)；鼠抗CD29-PE/CD45-FITC/CD90-PE -CyTM7(BD公司)；兔多克隆抗體心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin I，cTnI)、心肌連接蛋白(connexin43，Cx43)、兔單克隆抗體原肌球蛋白(tropomyosin，TPM)(Abcam公司)；兔免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒(北京四正柏公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的分離純化培養(yǎng)：麻醉后采用頸椎脫臼法處死大鼠，在無菌條件下取四肢長骨，IMDM沖出骨髓液過濾接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個(gè)/L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2)中培養(yǎng)。24 h后更換新的培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞，此后每72 h換液1次(計(jì)為P0代細(xì)胞)，鏡檢當(dāng)貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行第1次傳代，胰蛋白酶消化，雜質(zhì)細(xì)胞被去除。選增殖良好的P2代細(xì)胞增殖48 h后分為：1)對(duì)照組：僅加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，3 d后換液；2)PFT-α組：加入5 mL終濃度為250 μg/L PFT-α的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基換為不含PFT-α的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4周；3)BMP- 2組：加入5 mL終濃度為0.2 μg/L BMP- 2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基換為不含BMP- 2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4周；4)PFT-α和BMP- 2聯(lián)合組：加入10 mL終濃度分別為250 μg/L PFT-α和0.2 μg/L BMP- 2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基換為不含誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4周。

1.2.2 表面聯(lián)合標(biāo)記物鑒定BMMSCs：將P4代細(xì)胞消化制備成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×1010個(gè)/L并均勻分裝至5支5 mL離心管中，每管200 μL，分別加入熒光標(biāo)記的CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM7、CD29-PE+CD45-FITC+ CD90-PE-CyTM7抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，用BD流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測BMMSCs：取各組培養(yǎng)4周后的細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2-甲醇室溫孵育10 min(避光)，隨后加枸櫞酸鹽緩沖液微波爐修復(fù)20～30 min，自然冷卻，滴加適量非特異性染色阻斷劑室溫15 min，分別加cTnI、Cx43及TPM抗體(濃度均為1∶100)，放于濕盒中4 ℃孵育過夜(陰性對(duì)照組用PBS代替)?？瞻讓?duì)照用PBS代替，其他步驟按試劑盒說明操作，最后蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封片晾干，光鏡下觀察。各組隨機(jī)選取8張載玻片，光鏡下，每張載玻片均隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域視野，得到的結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 免疫熒光檢測BMMSCs：收集相應(yīng)細(xì)胞，開始步驟同免疫組化，非特異性染色阻斷后，加Cx43單克隆抗體放于濕盒中4 ℃孵育過夜(空白對(duì)照組用PBS代替)。PBS洗滌，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；PBS洗滌，CY3標(biāo)記的三抗室溫孵育1 h；PBS洗滌，加cTnI單克隆抗體放于濕盒中4 ℃孵育過夜。PBS洗滌，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗室溫1 h，PBS洗滌，風(fēng)干，用甘油封片并在激光掃描共焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 透射電鏡觀察：取各組誘導(dǎo)后培養(yǎng)至4周的細(xì)胞消化、離心，將上清液棄去，PBS沖洗1次，重復(fù)離心、沖洗2次，加入2.5%戊二醛使細(xì)胞形成團(tuán)塊于4 ℃條件下過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；10%鋨酸4 ℃條件下固定2 h；PBS洗滌3次，每次10 min；用50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水， EMbed 812包埋劑進(jìn)行包埋，超薄切片機(jī)切片，透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs形態(tài)學(xué)變化

P0代細(xì)胞呈圓形或方形，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，折光性好(圖1A)。誘導(dǎo)24 h后即可見細(xì)胞大部分貼壁，體積較小，形狀不規(guī)則，相鄰細(xì)胞伸出長短不一突起，且互連成片。誘導(dǎo)1周時(shí)，貼壁細(xì)胞體積增大，數(shù)量增多，大部分為長梭形，也有少量的三角形星形或多角形細(xì)胞，呈放射狀向四周擴(kuò)散(圖1B)。誘導(dǎo)4周左右，細(xì)胞呈緊密排列的長梭形，形態(tài)基本一致，有“肌島”樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖1C)。對(duì)照組細(xì)胞呈成纖維狀(圖1D)。

2.2 大鼠BMMSCs表面聯(lián)合標(biāo)記物的鑒定

CD45陽性率為0.3%， CD29陽性率為86.5%， CD90陽性率為84.7%(圖2)。這一結(jié)果符合大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。

2.3 免疫組織化學(xué)鑒定

誘導(dǎo)組細(xì)胞可見cTnI、Cx43及TPM均呈陽性表達(dá)，對(duì)照組為陰性。且PFT-α與BMP- 2聯(lián)合誘導(dǎo)組陽性表達(dá)細(xì)胞較其他單獨(dú)誘導(dǎo)組明顯增多(圖3)，聯(lián)合誘導(dǎo)組各標(biāo)志物的積分吸光值(integral absorbance，IA值)均最高(P<0.05)(表1)。

2.4 免疫熒光檢測結(jié)果

Cx43免疫熒光染色：胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)呈紅色，PFT-α組與BMP- 2組弱表達(dá)，PFT-α和BMP- 2聯(lián)合組表達(dá)增強(qiáng)；cTn I免疫熒光染色：胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)呈綠色，PFT-α組與BMP- 2組弱表達(dá)，PFT-α和BMP- 2聯(lián)合組表達(dá)增強(qiáng)(圖4)。

A.freshly isolated BMMSCs; B.BMMSCs induced by PFT-α and BMP- 2 for 7 days; C.BMMSCs induced by PFT-α and BMP- 2 for 28 days; D.the fourth generation BMMSCs

圖1倒置相差顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
Fig1Invertedphasecontrastmicroscopetoobservemesenchymalstemcells(×100)

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面聯(lián)合標(biāo)記物的表達(dá)Fig 2 Positive expression of surface antigen of BMMSCs

圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果Fig 3 Immunocytochemical staining of BMMSCs after induction(×400)

groupTPMCx43cTnIcontrol 1 602±218 1 788±209 1 596±194PFT-α35 283±2 037△27 439±2 695△29 106±2 143△BMP-240 574±1 989△26 486±2 508△24 973±2 216△combined48 329±2 189*△32 617±2 428*△33 269±2 214*△

*P<0.05 compared with BMP- 2 group;△P<0.01 compared with the control group.

2.5 透射電鏡觀察

透射電鏡下觀察誘導(dǎo)組細(xì)胞呈短圓柱狀，位于細(xì)胞中央的核較大，單一，呈橢圓形或圓形；胞質(zhì)內(nèi)可見平行排列的肌絲、線粒體和糖原等，超微結(jié)構(gòu)具有類心肌細(xì)胞樣的特點(diǎn)(圖5)。

3 討論

近年來大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究已經(jīng)證明，急性心肌梗死后移植BMMSCs對(duì)改善患者的心肌缺血狀態(tài)、促進(jìn)心功能的恢復(fù)有一定的療效。且BMMSCs在體外不同的誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等不同細(xì)胞系分化[3- 4]。而5-氮胞苷作為常見誘導(dǎo)劑可促進(jìn)BMMSCs定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，但5-氮胞苷還是一種抗腫瘤藥物，它的細(xì)胞毒性作用限制了其應(yīng)用。故而，尋求一種更高效和安全地誘導(dǎo)劑是當(dāng)前亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)觀察PFT-α和BMP- 2在體外分別及聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的效果，為BMMSCs的深入研究和臨床應(yīng)用提供思路及方法學(xué)基礎(chǔ)。

圖4 誘導(dǎo)組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)4周時(shí)cTnI和Cx43免疫熒光表達(dá)

A.the cytoplasm is rich in organelles,showing mitochondria, glycogen, and a small amount of lipid droplets(×8 000); B.large number of paralleled myfilament could be seen in the plasm(×6 000)

圖5骨髓間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)4周后的透射電鏡觀察結(jié)果

Fig5ObservationofBMMSCsafter4weeksofinductionbytransmissionelectronmicroscopy

實(shí)驗(yàn)中免疫組化法檢測cTnI、Cx43和TPM的表達(dá)，而cTnI是cTn的3個(gè)亞單位之一，僅于正常心肌中存在，在心肌收縮中調(diào)節(jié)粗、細(xì)肌絲間的相對(duì)滑行，實(shí)驗(yàn)中cTnI的表達(dá)意味著誘導(dǎo)細(xì)胞已具有心肌細(xì)胞最基本的收縮功能。Cx43是形成心肌間隙連接重要的蛋白之一,它的正常表達(dá)不僅能維持間隙連接通道電偶聯(lián)正常的功能，還能保持心臟正常電活動(dòng)與協(xié)調(diào)舒縮。TPM是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，由2條平行的多肽鏈扭成螺旋，與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，其主要作用是加強(qiáng)和穩(wěn)固肌動(dòng)蛋白絲，阻止肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白結(jié)合[5]。

研究人員已證實(shí) BMMSCs 在體外經(jīng) PFT-α誘導(dǎo)可分化為心肌樣細(xì)胞，該種細(xì)胞已初步具有心肌細(xì)胞的類似結(jié)構(gòu)和功能特征。而BMP- 2作為單一誘導(dǎo)劑，檢測了BMMSCs向心肌樣細(xì)胞的平均分化率為17.9%[6]。說明作為一種天然的多功能蛋白，BMP- 2對(duì)BMMSCs的誘導(dǎo)分化效率較好，對(duì)細(xì)胞的毒性小，是較理想的誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)各組誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，部分細(xì)胞已分化為心肌樣細(xì)胞，而正常對(duì)照組為成纖維細(xì)胞樣，且聯(lián)合誘導(dǎo)組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及各標(biāo)志物的IA值均最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明聯(lián)合誘導(dǎo)效果更好，與免疫熒光檢測結(jié)果一致。對(duì)誘導(dǎo)組透射電鏡觀察可見細(xì)胞胞質(zhì)有散在肌絲樣結(jié)構(gòu)，證實(shí)了誘導(dǎo)的有效性。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)鑒定結(jié)果表明，經(jīng)傳代培養(yǎng)增殖的細(xì)胞為純化的BMMSCs。

綜上所述，PFT-α和BMP- 2均可單獨(dú)誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，且兩者聯(lián)合應(yīng)用更加高效、安全，這為推動(dòng)BMMSCs移植應(yīng)用于治療缺血性心臟病提供思路和方法學(xué)基礎(chǔ)。