徐志剛，鄭 帥，楊澤冉，陳 雪，肖魯瑤，孫亞梅，張 杰*

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 1.消化內科； 2.北京市心肺血管疾病研究所 心血管生物研究室，北京 100029；3.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 放射介入科， 北京 100050)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種高發(fā)病率的臨床疾病，其易發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)，具有高病死率，是廣受關注的臨床疾病[1-4]。在胰腺炎過程中，胰腺細胞壞死與修復之間的平衡是一個中心問題。胰腺細胞凋亡可減少壞死，并有助于損傷修復[5-6]。但是具體調控機制尚不完全明確。

NR5A2是一個孤兒核受體，是NR5A亞家族的4個成員之一。NR5A2在胰腺組織中特異性表達，在維持細胞穩(wěn)定性、細胞分化和細胞損傷修復起著重要的作用[7-8]。既往研究表明，在胰腺上皮細胞中選擇性地失活NR5A2等位基因，足以引起胰腺炎[9]。這表明NR5A2可能參與急性胰腺炎的調控。具體機制方面，有研究發(fā)現(xiàn)，在腸黏膜上皮細胞中，NR5A2協(xié)同β-catenin調控周期蛋白基因的表達，促進腸黏膜上皮細胞損傷的修復[10]，然而，在胰腺腺泡細胞中是否存在類似機制尚不清楚。在本研究中，用雨蛙素刺激AR42J細胞建立急性胰腺炎模型，來檢測NR5A2在大鼠胰腺腺泡細胞系炎性反應應激條件下的功能及與β-catenin信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰腺外分泌細胞AR42J細胞系(ATCC公司)；胎牛血清、RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Corning公司)；雨蛙素(Sigma-Aldrich公司)；NR5A2 shRNA、β-catenin shRNA、EndoFectin轉染試劑、Opti-MEM、IL-1 Elisa試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒(GeneCopopia公司)；過表達NR5A2慢病毒及其對照病毒、Polybrene(Hanbio公司)；AV/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司)；細胞總蛋白提取試劑盒(Merck Millipore公司)；BCA蛋白質定量試劑盒和β-actin鼠源一抗(Ythxbiotech公司)；NR5A2兔源一抗和β-catenin兔源一抗(Abgent公司)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng)：用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)AR42J 細胞，培養(yǎng)基每1 ～ 2 d更換1次。當細胞增殖到75%～85%匯合度時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒過表達NR5A2：用24孔培養(yǎng)皿，每孔接種5×104個細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使感染時的細胞數(shù)約為8×104個/孔。向含5%滅活血清1640培養(yǎng)基中加入polybrene，使polybrene的最終濃度為5.0 mg/L。然后棄去24孔培養(yǎng)皿中的舊液，每孔加入24 μL慢病毒顆粒原液，慢病毒滴度為1×108TU/mL和476 μL上述培養(yǎng)基。同時，用空質粒轉染細胞，作為陰性對照組。輕輕混勻，細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h后，更換為正常培養(yǎng)液。48 h后熒光顯微鏡下觀察細胞感染率。蛋白免疫印跡驗證NR5A2在蛋白水平的表達量。

1.2.3 用shRNA分別沉默NR5A2和β-catenin：針對大鼠NR5A2和β-catenin靶基因，分別用化學合成的含eGFP標記的NR5A2 shRNA和含mcherryFP標記的β-catenin shRNA轉染AR42J細胞，轉染試劑為EndoFectin。細胞鋪6孔板，每孔5.0×105個細胞，24 h后轉染，轉染時每孔培養(yǎng)液體積為500 μL。在離心管中加入12.5 μL EndoFectin、125 μL Opti-MEM混勻。在另一離心管中加入DNA量為3 000 ng的質粒和Opti-MEM 125 μL混勻。室溫靜置5 min，充分混勻兩管中的溶液，室溫靜置20 min，形成 DNA-EndoFectin復合物。向每孔細胞中加入DNA-EndoFectin復合物，并輕輕渦旋培養(yǎng)板，轉染3 h后，添加1 mL含10%血清的培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃孵育，48 h后觀察有無熒光。

1.2.4 胰腺炎細胞模型的構建：將AR42J細胞接種到6孔板，接種細胞為1×106個/孔，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)達到60% ～ 70%的匯合度，用100 nmol/L的雨蛙素刺激細胞后，收取細胞，流式細胞計量術檢測細胞的凋亡率。收取細胞上清，ELISA檢測上清中炎性因子濃度。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：用AV/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。把AR42J細胞接種到6孔板中，使每孔細胞達1×106個。在24 h后，更換新的培養(yǎng)基，每孔細胞分別用100 nmol/L雨蛙素處理2、4、6和8 h。以磷酸鹽緩沖液(PBS)處理的細胞作為對照。用預冷的PBS洗滌細胞2次，輕輕吹打并收集細胞，于800 r/min離心5 min，用預冷的1×結合緩沖液重懸細胞1次，然后添加5 μL的annexinV-FITC混勻后，再加入5 μL的PI染色，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min，補加200 μL 1×結合緩沖液。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中的炎性因子：將AR42J細胞接種到6孔板中，每孔細胞數(shù)為1×106個。24 h后，培養(yǎng)基被移除，用100 nmol/L雨蛙素分別刺激1、2、4、6和8 h后收取上清。分別按照IL-1、TNF-α ELISA試劑盒操作步驟檢測細胞上清中各自的表達水平。

1.2.7 蛋白質提取和免疫印跡電泳檢測NR5A2和β-catenin含量：用細胞總蛋白提取試劑，細胞裂解液中加入PMSF，比例為100∶1，提取細胞總蛋白。按照BCA蛋白質定量試劑盒操作說明進行蛋白質濃度測定，每孔蛋白樣本上樣量為30 μg，進行SDS-PAGE電泳及轉膜，一抗NR5A2抗體(1∶500)、β-catenin抗體(1∶500)、β-actin抗體(1∶1 000)相應比例稀釋后于4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫避光孵育1 h。用LI-COR Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)分析條帶吸光度值，用β-actin條帶吸光度值校正，得到各條帶相對吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 雨蛙素刺激引起AR42J細胞炎性反應和凋亡，并抑制NR5A2水平

用100 nmol/L雨蛙素刺激AR42J細胞可時間依賴性地誘導AR42J細胞凋亡，刺激6 h的細胞凋亡率達到峰值(圖1A，B)。相應的，細胞上清中的TNF-α和IL- 1的水平在各時間點均明顯高于對照細胞組，在6 h達最高水平(圖1C)。隨著雨蛙素刺激時間的變化，NR5A2先降低后升高，24 h達最低水平，48 h后逐步恢復正常水平(圖1D)。

2.2 過表達NR5A2促進炎性反應應激條件下的細胞凋亡，且減輕細胞炎性反應

與慢病毒空載體感染的對照組相比，感染攜帶NR5A2慢病毒的細胞NR5A2蛋白含量顯著升高(圖2A)。NR5A2過表達組的細胞凋亡率顯著增加(圖2B)，細胞上清中炎性因子IL-1和TNF-α的濃度顯著降低(圖2C)。

2.3 沉默NR5A2抑制炎性反應應激條件下的細胞凋亡，且加重細胞炎性反應

與用scramble shRNA的對照組相比，沉默NR5A2組細胞的NR5A2蛋白表達量顯著降低(圖3A)，細胞凋亡率顯著降低(圖3B)，細胞上清中炎性因子IL-1和TNF-α的濃度顯著升高(圖3C)。

2.4 β-catenin信號通路參與NR5A2介導的細胞凋亡和炎性反應

與用β-catenin scramble shRNA轉染的對照組相比，沉默組β-catenin蛋白質含量顯著降低(圖4A)，細胞凋亡率顯著降低(圖4B)，同時細胞上清中IL-1和TNF-α炎性因子的濃度顯著增高(圖4C)。

3 討論

急性胰腺炎是一種高發(fā)病率的臨床疾病，發(fā)病機制尚不完全明確。NR5A2在胰腺腺泡細胞中特異性表達，可以激活一系列特定的基因，與細胞的損傷修復和穩(wěn)定性密切相關，參與胰腺外分泌功能的恢復[11]。同時，有報道在小鼠急性胰腺炎模型中，腺泡細胞中NR5A2會出現(xiàn)瞬間下調[8]；特異性地刪除胰腺NR5A2則會使小鼠胰腺炎模型的腺泡細胞修復不良、發(fā)生壞死，單倍體不足的胰腺炎小鼠SAP會加重[9]。這些報道提示NR5A2可以促進胰腺細胞的修復。

A.representative flow cytometry graphs of apoptosis tests; B.statistic graph of apoptosis rate; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant; D.representative Western blot graph of NR5A2 (Value of NR5A2/β-actin: 0 hour, 0.402±0.197; 2 hours, 0.364±0.245; 4 hours, 0.350±0.228; 8 hours, 0.344±0.205; 12 hours, 0.324±0.195; 24 hours, 0.312±0.193; 48 hours, 0.375±0.164);*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

圖1雨蛙素刺激引起AR42J細胞凋亡和炎性反應，并下調NR5A2水平

在具體的修復功能方面，鑒于既往研究證實，受損傷腺泡細胞的凋亡有利于胰腺組織的修復，細胞的凋亡率與SAP的嚴重程度呈負相關[12]；同時，誘導細胞凋亡后，IL-1 mRNA在胰腺組織的水平很低，表明誘導細胞凋亡后炎性反應被抑制[6]，因此促進凋亡可能會減弱胰腺炎的嚴重性。為驗證這一潛在作用機制，本研究采用在胰腺炎腺泡細胞中過表達NR5A2的方法，發(fā)現(xiàn)NR5A2過表達能促進胰腺炎腺泡細胞凋亡，抑制IL-1、TNF-α炎性因子的產生，提示NR5A2通過促進凋亡抑制炎性反應，對胰腺腺泡細胞起保護作用。

NR5A2在急性胰腺炎中誘導胰腺細胞凋亡的下游信號分子仍不清楚。有報道，NR5A2可以直接與Wnt /β-catenin信號通路相互作用，從而促進腸道上皮細胞損傷的修復[10, 13]。而Wnt信號通路參與了細胞增殖、分化、凋亡、遷移和干細胞自我更新的調控[14]，并在炎性反應中起著關鍵的作用[15]。因此本研究著眼于Wnt /β-catenin信號通路，發(fā)現(xiàn)在過表達NR5A2的細胞中，通過抑制β-catenin表達，會使細胞凋亡減少并且炎性細胞因子(IL-1、TNF-α)增加，證實在胰腺炎中，β-catenin可能介導NR5A2在腺泡細胞炎性反應應激條件下的調節(jié)作用。

A.Western blot graph and statistic result of NR5A2 after lentivirus vectors infection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after lentivirus vectors infection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after lentivirus vectors infection; LV-null.empty lentivirus vector; LV-NR5A2.lentivirus vector carrying NR5A2 gene;*P<0.05,**P<0.01 compared with LV-null group

圖2慢病毒載體在AR42J細胞中過表達NR5A2促進細胞凋亡并抑制炎性因子水平

綜上所述，本研究結果證明了NR5A2在保護胰腺細胞、減少炎性反應損傷中起著重要的作用，β-catenin信號通路參與了NR5A2的上述作用。然而，NR5A2如何調控Wnt /β-catenin信號通路起作用仍然不清楚，有待進一步研究。此外，NR5A2的保護作用有待在動物模型水平上進一步的驗證。

A.Western blot graph and statistic result of NR5A2 after NR5A2 shRNA transfection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after NR5A2 shRNA transfection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after NR5A2 shRNA transfection; Scr sh-RNA.scramble shRNA; NR5A2 sh-RNA.shRNA which targeted NR5A2；*P<0.05,**P<0.01 compared with scramble shRNA group

圖3shRNA在AR42J細胞中抑制NR5A2下調細胞凋亡并上調炎性因子水平

A.Western blot graph and statistic result of β-catenin after shRNA transfection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after β-catenin shRNA transfection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after β-catenin shRNA transfection； Scr sh-RNA.scramble shRNA; β-catenin sh-RNA.shRNA which targeted β-catenin; LV-NR5A2.lentivirus vector carrying NR5A2 gene;*P<0.05,**P<0.01 compared with LV-NR5A2+scr sh-RNA group

圖4shRNA在過表達NR5A2AR42J細胞中抑制β-catenin下調細胞凋亡并上調炎性因子水平