何靜宇，趙 翔，張 頁(yè)

(北京大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系， 北京 100191)

靛紅(isatin)是一種天然產(chǎn)物，靛紅及其衍生物具有多種生物活性，尤其在抗腫瘤方面凸顯作用[1]。靛紅衍生物3MCIC是本實(shí)驗(yàn)室之前合成的有效抗癌藥物[2]。靛紅衍生物 IF203 通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌 HepG2 細(xì)胞凋亡[3]。2013年合成的鄰硝基苯基靛紅查爾酮不僅自身有強(qiáng)抗癌活性，而且與不同藥物聯(lián)用具有特異的協(xié)同或拮抗效果[4]。靛紅衍生物 IF239對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著，其作用機(jī)制獨(dú)特，具有潛在應(yīng)用前景[5]。因此，合成新型的靛紅衍生物是開發(fā)有效抗腫瘤藥物的重要途徑。肝癌是中國(guó)常見的腫瘤之一，2010年以來(lái)肝癌占全國(guó)癌發(fā)病率的第3位。肝癌對(duì)已知放、化療敏感性很低，尋找新的藥物更具挑戰(zhàn)[6]。本實(shí)驗(yàn)室利用靛紅為基準(zhǔn)合成1種新型的N取代靛紅衍生物(3MMIS)，實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，為這種新型藥物的開發(fā)利用提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞系：人肝癌HepG2、BEL-7402、小鼠乳腺癌4T1和人胎肝L02細(xì)胞系(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系保存)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Israel Beit Haemek公司)；Anti-calnexin(BD Biosciences公司)； Anti-cyclin D1、Anti-c-Myc(ZSGB-BIO公司)；Anti-cyclin A、 Anti-cyclin E和Anti-E2F1(Santa Cruz Biotechnology公司)； β-Tubulin、單丹磺酰戊二胺(Sigma公司)；PNPP(Amresco公司)。

1.2 方法

1.2.1 酸性磷酸酶法(APA)檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用：取對(duì)數(shù)增殖期的HepG2、4T1、7402和L02細(xì)胞系等，制成細(xì)胞懸液，待其貼壁。用 3MMIS配制成母液，經(jīng)培養(yǎng)液稀釋，再倍比稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625和0.313 mg/L等不同濃度的溶液。利用含不同稀釋濃度3MMIS的RPMI-1640培養(yǎng)基，按體積比1∶1的量，分別加入預(yù)先貼壁培養(yǎng)24 h、處于對(duì)數(shù)增殖期的正常人肝細(xì)胞及多種人腫瘤細(xì)胞的96孔板中，混勻后于37 ℃培養(yǎng)。用酸性磷酸酶法(APA)檢測(cè)細(xì)胞增殖率，在酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A)。按下式計(jì)算N取代靛紅衍生物作用下的細(xì)胞百分活率：細(xì)胞百分活率=(A實(shí)驗(yàn)孔平均值÷A溶劑對(duì)照組平均值)×100%

1.2.2 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):取對(duì)數(shù)增殖期的HepG2細(xì)胞，消化重懸后接種于6孔板中，每孔加3 mL細(xì)胞懸液(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)。接種24 h后，向各孔中加入3 mL含3MMIS的培養(yǎng)液，終濃度分別為0.5和1 mg/L，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)不同時(shí)間段。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.3 相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)：接種對(duì)數(shù)期增殖的細(xì)胞，待增殖約匯合70%～80%時(shí)，以終濃度分別為0.5和1 mg/L的3MMIS作用細(xì)胞12、24和48 h，回收全部細(xì)胞到1.5 mL離心管中，BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液制作成上樣樣品。每個(gè)樣本孔加入40 μg蛋白，行10% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶封閉 50 min，依據(jù)抗體工作濃度孵育一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天TBST洗滌3次，二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST避光洗滌3次，化學(xué)發(fā)光液充分和均勻地浸潤(rùn)硝酸纖維素膜進(jìn)行發(fā)光， X射線膠片曝光1～15 min。將膠片顯影和定影。

1.2.4 微管組裝水平檢測(cè)：取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制成細(xì)胞懸液。按8×107個(gè)/L的濃度接種于大培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入經(jīng)二甲基亞砜溶解后再經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至不同濃度的3MMIS；以紫杉醇作為抑制微管解聚的對(duì)照；以秋水仙素作為抑制微管聚合的對(duì)照，溶劑對(duì)照組加入0.1% DMSO。培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞加入200 μL低滲細(xì)胞裂解液，混勻后常溫裂解2 min，25 ℃ 12 000 r/min，離心6 min，收集上清，加入SDS-PAGE上樣緩沖液即為含游離微管蛋白的樣品；沉淀加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液200 μL，于離心管中用聚乙烯研棒手動(dòng)碾磨，即為含聚合微管蛋白的樣品。上清與沉淀樣品煮沸后，經(jīng)SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，Western blot檢測(cè)β-tubulin蛋白的改變。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)：接種對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，待細(xì)胞匯合70%～80%時(shí)，以終濃度0和1 mg/L的3MMIS分別作用于細(xì)胞6、12、24和48 h后，收集全部細(xì)胞，經(jīng)過(guò)70%乙醇固定，細(xì)胞篩過(guò)濾，PBS清洗，PI染色后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析。

1.2.6 自噬小體熒光染色：將HepG2細(xì)胞接種于預(yù)先放有蓋玻片的24孔板中，每孔1 mL細(xì)胞懸液(含有5×104個(gè)細(xì)胞)培養(yǎng)24 h。向各孔中分別加入終濃度為0和1 mg/L的3MMIS，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)4和24 h。終止細(xì)胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS沖洗3次，0.05 nmol/L單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine)37 ℃染色10 min，PBS沖洗4次，加入防淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)室利用靛紅為基礎(chǔ)，在N位進(jìn)行取代衍生合成3MMIS(圖1)。

圖1 3MMIS的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of 3MMIS

2.2 酸性磷酸酶法(APA)測(cè)定3MMIS的體外抗腫瘤活性

藥物作用48 h后，酸性磷酸酶法測(cè)定細(xì)胞的存活率，與陰性對(duì)照組比較，通過(guò)GraphPad Software Prism 6.0軟件，顯示在不同濃度的N代靛紅衍生物作用下腫瘤細(xì)胞的存活百分率劑量反應(yīng)曲線。可以看出3MMIS對(duì)人肝癌HepG2和7402細(xì)胞、小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞都顯示較好抑制活性，而對(duì)人胎肝L02細(xì)胞毒性相對(duì)較小(圖2)。對(duì)L02、HepG2、4T1、7402細(xì)胞的IC50為1.5、0.43、0.56和0.36 mg/L。

2.3 鏡下觀察3MMIS作用下HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化

倒置相差顯微鏡下顯示，對(duì)照組細(xì)胞增殖狀況良好，鋪展均勻，呈扁平多邊形，細(xì)胞連接緊密。與對(duì)照組相比，0.5 mg/L濃度的3MMIS作用下HepG2細(xì)胞在6 h出現(xiàn)少量細(xì)胞變圓，在12 h變圓數(shù)量進(jìn)一步增多，在24 h基本全部細(xì)胞都變圓并且出現(xiàn)細(xì)胞碎裂伴隨囊泡出現(xiàn)，變圓比例接近100%(圖3)。

圖2 藥物3MMIS作用于3種腫瘤細(xì)胞系和人胎肝細(xì)胞48 h的增殖抑制劑量曲線圖Fig 2 Effect of 3MMIS on the proliferation of three tumor cell lines and human fetal hepatocytes for 48 hours

圖3 光學(xué)顯微鏡下顯示3MMIS對(duì)HepG2細(xì)胞的形態(tài)影響Fig 3 Morphological changes in 3MMIS treated HepG2 cells were observed under a light microscope(×200)

2.4 3MMIS作用下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化

圖4 3MMIS作用下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化Fig 4 Changes of cell cycle related proteins under the action of 3MMIS

分別取1和0.5 mg/L的3MMIS作用于HepG2細(xì)胞24和48 h，檢測(cè)相關(guān)周期蛋白的水平(圖4)。3MMIS作用下在24和48 h，cyclin B1持續(xù)增多。Cyclin D1、 cyclin E、 E2F1、 Rb、 c-Myc顯著下調(diào)。Cyclin A在24 h變化不明顯，在48 h顯著下調(diào)。Cdc25A、CDK4、CDK2無(wú)明顯改變。

2.5 微管組裝水平變化

分別以3MMIS(0.5和1 mg/L)、800 nmol紫杉醇(PTX)和 100 nmol秋水仙素(Col)作用于體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞12 h后， Western blot結(jié)果(圖5)顯示，與加入DMSO的對(duì)照組(Ctrl)相比，紫杉醇導(dǎo)致上清(S)中微管蛋白明顯減少，裂解液沉淀(P)中聚合微管蛋白明顯增多；秋水仙素抑制微管聚合，裂解液上清中可溶的微管蛋白增多；3MMIS作用下與對(duì)照組相比，沉淀中聚合的微管蛋白減少，上清中游離的微管蛋白相應(yīng)增多，可溶性微管蛋白與聚合微管蛋白的比值增加，表明3MMIS可減少微管的聚合(圖5)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

用3MMIS作用于體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞6、12、24和36 h，分別收集細(xì)胞,觀察對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞被阻滯在G2/M時(shí)期的比例不斷增多，在藥物作用12、24 h阻滯比例高達(dá)83.7%以上(圖6)。

2.7 3MMIS對(duì)細(xì)胞自噬的影響

分別以0.5和1 mg/L的3MMIS作用于HepG2細(xì)胞12 h，檢測(cè)3MMIS對(duì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62的影響。與對(duì)照組相比，3MMIS作用下，p62蛋白明顯減少，高濃度作用下更明顯(圖7A)。單丹磺酰戊二胺熒光染色法檢測(cè)3MMIS對(duì)自噬的影響。與對(duì)照相比，1 μg/mL的3MMIS作用于HepG2細(xì)胞4 h自噬小體明顯增多(圖7B)。

3 討論

靛紅衍生物由于其低毒性的特點(diǎn)近年來(lái)成為研究抗腫瘤的熱門方向。N-烯丙基靛紅可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，通過(guò)線粒體相關(guān)途徑促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡[7]。多種N取代靛紅衍生物可以通過(guò)抑制醛脫氫酶從而達(dá)到抑制腫瘤干細(xì)胞的作用，為研發(fā)抗腫瘤藥物提供新的思路[8]。二溴化N-烷基靛紅衍生物和母體化合物5，7-二溴靛紅通過(guò)促進(jìn)微管解聚，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[9]。

以微管為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物是現(xiàn)今抗腫瘤藥物研究的重要領(lǐng)域，抗微管藥破壞微管的動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)或者抑制微管的聚合， 從而引起腫瘤細(xì)胞紡錘絲形成障礙，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯誘導(dǎo)其死亡。有絲分裂災(zāi)難是指在細(xì)胞分裂時(shí)期，由于分裂異常，DNA損傷和紡錘體形成障礙時(shí)產(chǎn)生的一種細(xì)胞死亡方式，常常伴隨有四倍體或者異倍體出現(xiàn)。有絲分裂災(zāi)難大多伴隨細(xì)胞G2/M期的周期阻滯，大多數(shù)細(xì)胞體積變大，變大細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)核和凝集的染色質(zhì)[10]?？刮⒐芩幠軌蛘T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難已被證實(shí)，并越來(lái)越受到人們關(guān)注。

圖6 3MMIS作用于HepG2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的流式分析結(jié)果和相對(duì)應(yīng)的時(shí)間曲線圖Fig 6 3MMIS flow analysis results at different time points of HepG2 cells and corresponding time plots

A.effect of 3MMIS on autophagy-associated protein p62; B.immunofluorescence observation of changes in autophagy vesicles(×100)

圖73MMIS作用下自噬蛋白p62含量變化和免疫熒光觀察細(xì)胞中自噬小泡變化
Fig7Changesofautophagyproteinp62andautophagyvesiclesundertheactionof3MMIS

經(jīng)典藥物紫杉醇可抑制微管蛋白解聚。其作用機(jī)制可能是通過(guò)擾亂細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞分裂間期的微管體系，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難和死亡[11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道阿霉素作用于人類白血病細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中用低劑量作用后，Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯， cyclinB1、cyclinA和cyclinD1蛋白表達(dá)量升高，進(jìn)而出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)難并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。用reversine作用于K562細(xì)胞，引發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難和凋亡[13]。自噬是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的分解代謝過(guò)程，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)胞內(nèi)或胞外應(yīng)激的一種重要機(jī)制[14]。本實(shí)驗(yàn)室合成的新型抗微管藥物N取代靛紅衍生物3MMIS可以減少微管聚合，將HepG2細(xì)胞阻滯在G2/M期，并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。