軒轅東，劉雅娟，任永康，徐 璐，朱 娜，楊銳英*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院 心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750004；4.寧夏人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750004)

正常人血液循環(huán)中脂聯(lián)素(adiponectin，APN)含量與左心室體積和室壁厚度具有負(fù)相關(guān)性，推測(cè)APN可能參與了心肌細(xì)胞肥大過(guò)程[1]。高濃度胰島素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[2]。APN通過(guò)與AdipoR1結(jié)合后可以激活A(yù)MPK及其下游的信號(hào)通路[3-4]，有報(bào)道PI3K/AKT可以作為AMPK下游的通路發(fā)揮作用[6]，因此，APN可通過(guò)AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT途徑發(fā)揮作用。APN是否可以抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建高濃度胰島素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大模型，觀察APN對(duì)高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用及其機(jī)制，為治療慢性心力衰竭提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)1～3日齡SD大鼠[購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(寧)2015-0001]。慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、DMEM和5-溴脫氧尿核苷(Sigam公司)；胎牛血清(Gibico公司)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇凱基生物科技技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠E-53/ AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：體外分離大鼠心肌細(xì)胞，調(diào)整至適當(dāng)濃度后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)；將細(xì)胞分為4組：1)對(duì)照組：第1～6天使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第7天更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d；2)模型組：前7天與正常對(duì)照組處理相同，第8天用1×10-6mol/L胰島素處理2 d；3)干預(yù)組：前7天與正常組處理相同，第8天用胰島素+7.5 mg/L脂聯(lián)素處理2 d； 4)轉(zhuǎn)染組：第1～3天使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第4天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至第6天，此后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，胰島素+脂聯(lián)素處理2 d。各組分別培養(yǎng)至第9天收集樣本進(jìn)行心肌細(xì)胞蛋白含量、3-甲基組氨酸(3-methyl histidine，3-MH)、細(xì)胞表面積、AdipoR1、AMPK、PI3K及AKT蛋白表達(dá)含量的檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞表面積的測(cè)定: 將細(xì)胞懸液接種于24孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)干預(yù)后制成細(xì)胞爬片。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞 20 min，0.1% Triton X-100透化5 min，1% BSA封閉1 h，E-53(1∶1 000)室溫孵育1 h，熒光兔二抗(1∶2 000)避光孵育1 h。DAPI 染核 5 min，熒光顯微鏡下觀察并攝片。Image-Pro Plus軟件分析計(jì)算細(xì)胞表面積。

1.2.3 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)前1天，將(3～5)×105細(xì)胞/孔接種至6孔板內(nèi)，每孔2 mL培養(yǎng)基。吸去原培養(yǎng)基，每孔加入 MOI=50的病毒體積。放入孵箱進(jìn)行培養(yǎng)12 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平: 用0.25%胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗AdipoR1、PI3K(1∶1 000)、AMPK、AKT(1∶500)于4 ℃孵育過(guò)夜，IgG兔二抗(1∶5 000)于37 ℃孵育1 h，ECL顯色。以GAPDH作為內(nèi)參照。顯影條帶用軟件Gelpro32分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞肥大情況

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.01)，與模型組比較，干預(yù)組心肌細(xì)胞相對(duì)表面積回降(P<0.01)(圖1)；與干預(yù)組比較，轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞表面積增大(P<0.01)(圖1)。

2.2 各組心肌細(xì)胞蛋白含量及3-MH釋放

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞蛋白含量增加(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組細(xì)胞蛋白含量回降(P<0.05)；與干預(yù)組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白含量增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，模型組3-MH釋放量顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組3-MH釋放量明顯回升(P<0.01)；與干預(yù)組比較，轉(zhuǎn)染組3-MH釋放量顯著減少(P<0.01)(表1)。

2.3 各組心肌細(xì)胞AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，模型組AMPK、PI3K和AKT表達(dá)減少(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT表達(dá)增加(P<0.05)，轉(zhuǎn)染組AdipoR1表達(dá)相對(duì)減少(P<0.05)；與干預(yù)組相比，轉(zhuǎn)染組AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT明顯降低(P<0.05)(圖2，表2)。

3 討論

APN與心室肥厚呈反比關(guān)系[6-8]，外源性APN可以改善胰島素抵抗導(dǎo)致的大鼠心室肥厚[9]。在體實(shí)驗(yàn)研究由于受多種因素影響，不能有效反映APN在改善心室重構(gòu)中的作用。本實(shí)驗(yàn)用高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞可更直觀觀察APN對(duì)高濃度胰島素誘導(dǎo)的大鼠肥大心肌細(xì)胞的作用。3-MH是存在于心肌細(xì)胞蛋白中的一種轉(zhuǎn)錄后修飾的氨基酸[10]，由于缺乏特異性的tRNA，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)分解代謝時(shí)所釋放的3-MH不能參與新蛋白質(zhì)的合成，因此，可以作為心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的生物學(xué)標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)：高濃度胰島素可使大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量及細(xì)胞表面積明顯增加，3-MH釋放量減少，表明高濃度胰島素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[1]。有研究表明，胰島素與胰島素樣生長(zhǎng)因子有較高的同源性[1]，可結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子受體促進(jìn)心肌細(xì)胞的蛋白合成速度及增加蛋白含量，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。胰島素也可能是通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合后通過(guò)上調(diào)心肌營(yíng)養(yǎng)素-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)這種作用[11]。

△P<0.01 compared with model;#P<0.01 compared with intervention

圖1 各組心肌細(xì)胞表面積Fig 1 Surface area of cardiomyocytes in each

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

A.control group; B.model group; C.intervention group; D.transfection group圖2 各組 AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表達(dá)Fig 2 Protein expressions of AdipoR1, AMPK, PI3K and AKT in each group

groupAdipoR1AMPKPI3KAKTcontrol0.82±0.020.83±0.020.82±0.021.04±0.03model0.81±0.020.75±0.02*0.61±0.02*0.22±0.02*intervention1.24±0.04#1.15±0.03#1.16±0.04#0.52±0.02#transfection0.65±0.040.75±0.020.60±0.020.22±0.01

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

siRNA可以針對(duì)性選擇RNA雙鏈中的一條鏈進(jìn)行重組，導(dǎo)致mRNA降解，從而限制特定基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用AdipoR1 siRNA 轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它可以明顯降低心肌細(xì)胞AdipoR1的表達(dá)，由于AdipoR1是APN在心肌細(xì)胞發(fā)揮作用的必要條件，因此AdipoR1 siRNA可在一定程度上阻斷外源性APN的生理作用。

APN是否具有抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用，尚不明確。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APN可以使心肌細(xì)胞蛋白含量及細(xì)胞表面積減小，3-MH釋放量增加，提示APN在一定程度上可以抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。APN與AdipoR1相結(jié)合后有胰島素增敏和抗炎等作用[12]。用APN干預(yù)大鼠的趾長(zhǎng)伸肌時(shí)觀察到APN與其受體結(jié)合后可活化AMPK[13]。有報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)APN及其受體活化AMPK，最終放大了PI3K傳導(dǎo)信號(hào)，提示PI3K/AKT可作為AMPK下游通路發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。關(guān)于APN抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制國(guó)內(nèi)外鮮有研究，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性APN干預(yù)可以使心肌細(xì)胞中的AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表達(dá)明顯增加，表明APN可能是通過(guò)上調(diào)AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT的方式來(lái)抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。本實(shí)驗(yàn)用AdipoR1 siRNA沉默AdipoR1的表達(dá)，阻斷APN的作用后發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中的AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表達(dá)均未發(fā)生明顯變化，進(jìn)一步提示AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT是APN抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的途徑之一。

綜上所述，APN可通過(guò)上調(diào)AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT途徑抑制高濃度胰島素所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。