李雪華，侯仕芳，周艷華，何志旭，*，舒莉萍，，4*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)院 兒科學(xué)教研室； 2.組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心； 3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室；4.動物實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004)

lmna(lamin A/C)基因是核纖層蛋白合成的關(guān)鍵基因，是細(xì)胞核形態(tài)及功能的主要決定因素，與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄翻譯活動密切相關(guān)。lmna突變可導(dǎo)致早衰[1-2]，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效治療方法。因此，研究LMNA下調(diào)時(shí)細(xì)胞凋亡機(jī)制對尋找核纖層蛋白病治療方法有一定意義。

嗎啡代寡核苷酸(morpholine oligonucleotide, MO)通過抑制mRNA的剪切和翻譯來抑制基因表達(dá)。有研究證實(shí)：將lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)粒同特異性嗎啉代寡核苷酸共注入斑馬魚單細(xì)胞期的胚胎，各時(shí)相胚胎中綠色熒光均消失，說明lmna-MO能有效下調(diào)lmna基因[3]。

AKT磷酸化是激活A(yù)KT通路的重要一步，p-AKT通過抑制凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活[4]。激活的AKT能夠使絲氨酸、蘇氨酸磷酸化，從而誘導(dǎo)抗凋亡蛋白基因的表達(dá)。BCL-2家族可辨識促凋亡成員，避免細(xì)胞進(jìn)入凋亡。細(xì)胞的存活受到AKT、BCL-2蛋白的共同調(diào)控，且AKT的表達(dá)對BCL-2起著重要的調(diào)控作用[5-6]。本研究利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)下調(diào)斑馬魚lmna基因，探討核纖層蛋白異常與細(xì)胞凋亡機(jī)制之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:野生型Tüebingen斑馬魚系由本課題組自行飼養(yǎng)培育。養(yǎng)殖方法：在帶有過濾和消毒的恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖，光照時(shí)間12 h/d,水溫(28±2)℃，喂食草履蟲及豐年蟲。

1.1.2 試劑:Western blot免染膠試劑盒(Bio-Rad公司)、一抗(S473 p-AKT蛋白、AKT蛋白、BCL-2蛋白)(Gene Tex公司)、Annexin-V PE/7AAD凋亡試劑盒(BD公司)、蛋白酶K(Sigma公司)，PBS溶液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(四季青試劑公司)，二抗、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、TBST溶液(碧云天試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 下調(diào)斑馬魚lmna基因：采用顯微注射技術(shù)，將lmna-MO注射入單細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚胚胎中，放入溫箱(30±2)℃保存，待胚胎發(fā)育至24和72 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測凋亡：每組收集胚胎50枚，用1×PBS清洗3次，冰上研磨，加入500 μL 0.25%的胰蛋白酶，38 ℃水浴30 min，每隔10 min吹吸1次；加入1 mL FBS，將組織液放入BD膜中過濾后移至新離心管中；800 r/min離心5 min，去上清；加入0.9×PBS/FBS 500μL，800 r/min離心5 min，去上清；加入0.9×PBS/FBS 100 μL和1×PBS 300 μL輕混勻；避光加入Annexin-V PE/7AAD凋亡試劑。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性及可靠性，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次以上。

1.2.3 Western blot檢測凋亡蛋白的表達(dá):每組收集胚胎各50枚，用1×PBS清洗3次，加入蛋白裂解液，冰上研磨，3 537 r/min離心5 min，取上清；加入蛋白緩沖液，沸水中煮5～10 min，直至蛋白質(zhì)充分變性，-80 ℃保存；配膠過程按試劑盒說明書操作，灌膠后插入梳子， 30 min后取出梳子， 上樣， 電泳250 V恒壓30 min，PVDF膜甲醛浸泡，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，搖床封閉1 h；剪膜；4 ℃搖床孵育一抗過夜；洗膜；常溫?fù)u床孵育二抗，再次洗膜；根據(jù)凝膠成像結(jié)果檢測p-AKT、AKT及BCL-2蛋白表達(dá)量，圖片數(shù)據(jù)用Image J及GraphPad Prism 5.0軟件處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果

lmna基因的下調(diào)可引起細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞早期凋亡更明顯(P<0.01)(圖1,2)。

2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果

p-AKT：野生型組較顯微注射后24和72 h組低，且顯微注射72 h組較24 h組高(P<0.01)；AKT：野生型組較顯微注射后24和72 h組低，且顯微注射24 h組較72 h組高(P<0.05)；BCL-2：野生型組較顯微注射后24和72 h組高(P<0.05)(圖3～5)。

圖1 野生型、注射lmna-MO后24及72 h胚胎細(xì)胞凋亡情況Fig 1 Apoptosis of wild type embryo cells, 24 and 72 hours embryo cells after microinjection of lmna-MO

*P<0.05,**P<0.01 compared with wide type圖2 斑馬魚胚胎早、晚期細(xì)胞凋亡情況統(tǒng)計(jì)圖Fig 2 Statistical graph of apoptosis in zebrafish embryos at early and late n=3)

*P<0.01 compared with wide type圖3 Western blot檢測p-AKT蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of p-AKT protein by Western n=3)

*P<0.05 compared with wide type圖4 Western blot檢測AKT蛋白的表達(dá)Fig 4 Expression of AKT protein by Western n=3)

*P<0.05 compared with wide type圖5 Western blot檢測BCL-2蛋白的表達(dá)Fig 5 Expression of BCL-2 protein by Western n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚作為研究對象，其體外受精、易繁殖等優(yōu)勢為研究生物早期組織器官的發(fā)育提供了便利[7-8]。嗎啉代寡核苷酸技術(shù)的原理是基于RNA的核糖骨架被嗎啉環(huán)替代，從而抑制基因表達(dá)，但該技術(shù)存在時(shí)效短這一缺點(diǎn)：將lmna-MO注射入斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，其熒光從6 h在胚胎內(nèi)廣泛表達(dá)，至30 h時(shí)逐漸減少，72 h則完全消失[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測到不同時(shí)相的胚胎存在不同程度的凋亡現(xiàn)象，注射lmna-MO 72 h后，胚胎細(xì)胞凋亡情況仍明顯，說明lmna下調(diào)引起細(xì)胞凋亡存在不可逆趨勢。

lmna基因的缺失可引起細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡異常[9]，細(xì)胞膜中的磷酯酰絲氨酸(PS)在凋亡早期會由脂膜從內(nèi)翻向外，暴露的PS與凋亡細(xì)胞膜結(jié)合的同時(shí)可被Annexin V檢測到，PE作為熒光素將對Annexin V標(biāo)記，通過7-AAD標(biāo)記的DNA降解情況進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析：LMNA基因的下調(diào)可引起細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞早期凋亡更明顯，故細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可能與lmna-MO的暴露時(shí)間及胚胎發(fā)育情況有關(guān)。

Western blot檢測到lmna基因下調(diào)后p-AKT(S473)表達(dá)增加，表明激活的AKT使底物蛋白特定部位的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化，p-AKT在抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活過程中起到了至關(guān)重要的作用。p-AKT蛋白與AKT蛋白表達(dá)量無正相關(guān)性，可能是由于藥物暴露時(shí)間越長，AKT通路活化程度越高，抑制凋亡程度越明顯；但是也不能排除存在其他調(diào)控機(jī)制參與AKT活化過程。

AKT位于多條重要信號通路的交叉點(diǎn)，能夠作用于下游關(guān)鍵的蛋白BCL-2,BCL-2的過度表達(dá)可抑制凋亡過程的發(fā)生[10-12]。大量研究表明：AKT通路對細(xì)胞凋亡有抑制作用,AKT作為BCL-2的上游，對BCL-2蛋白有抑制作用， 從而抑制細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)lmna基因突變后，lmna蛋白表達(dá)消失，BCL-2作為lmna上游，由于缺乏下游受體蛋白，故BCL-2蛋白表達(dá)減少；AKT通路抑制BCL-2蛋白表達(dá)減少，故AKT蛋白表達(dá)增加。BCL-2蛋白雖然在線粒體上表達(dá)，但是仍可以通過AKT通路和一系列信號蛋白的參與來影響核纖層蛋白的表達(dá)(圖6)。

lmna可能在調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程中起著重要的作用，p-AKT參與AKT通路激活過程，且lmna引起細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與AKT、BCL-2蛋白的表達(dá)情況有關(guān)。迄今為止，lmna突變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍然有許多學(xué)者在進(jìn)行研究，但是核纖層蛋白病的潛在分子機(jī)制仍亟待解釋。

圖6 與核纖層蛋白相關(guān)的AKT通路Fig 6 lmna and AKT pathway