周國雁，隆文杰，湯翠鳳，雷涌濤，蔡 青，伍少云

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650205)

種子是被子、裸子植物最主要的繁殖器官和遺傳物質(zhì)的載體[1]，其質(zhì)量或發(fā)芽力的高低，決定了種子的貯藏壽命和需要重新繁殖的時(shí)間。影響種子發(fā)芽力的因素雖然有很多，如收獲前的病蟲害、降水，收獲后的加工脫粒及運(yùn)輸方法，等等。但是，對(duì)種子發(fā)芽力影響最大的因素則是種子本身的構(gòu)造、化學(xué)成分、休眠程度等遺傳因素。種子的自然壽命是其從完全成熟到自然衰老直至死亡所經(jīng)歷的時(shí)間期限，而貯藏壽命則是其在干燥保藏后保持一定生存能力的時(shí)間[2]，是自然壽命的有限延長。

研究表明，休眠是影響種子發(fā)芽力最主要的遺傳因素。有休眠性的種子，一般也都有較低的發(fā)芽力，在貯藏后，它們中活下來的部分雖然比高活力種子中活下來的部分更可能有正態(tài)或接近正態(tài)分布的特征[3]，但是，它們的貯藏壽命不能用生存力模型[4]預(yù)測(cè)。因?yàn)樾菝叻N子實(shí)際維持一定生存能力的期限可能比生存力模型預(yù)測(cè)到的要長得多[4]。種子休眠對(duì)種子貯藏壽命的負(fù)作用已有報(bào)道，在擬南芥種子中，深休眠的種子有較短的貯藏壽命，淺休眠的種子則有較長的貯藏壽命[5]，即種子休眠程度與其貯藏壽命呈顯著的負(fù)相關(guān)[2]。但這種負(fù)作用沒有在普通小麥種(Triticumaestivum)普通小麥亞種(ssp.aestivum)的栽培品種中被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樾←湻N子的休眠和貯藏壽命是被獨(dú)立控制的[6-7]。

不同品種甚至同一品種在不同地點(diǎn)或同一地點(diǎn)不同年份繁育的種子，其發(fā)芽力和貯藏壽命都可能不同。研究和比較不同種子貯藏壽命的2個(gè)重要指標(biāo)，分別是衰退率和半活期[4]，前者是種子發(fā)芽率(y)和貯藏時(shí)間(x)線性回歸方程的回歸系數(shù)，也是回歸直線的斜度和種子死亡時(shí)間分布的標(biāo)準(zhǔn)差[4-8]，后者是種子在貯藏過程中發(fā)芽率降至50%的貯藏時(shí)間[4-8]。本研究通過5份育成水稻品種種子的發(fā)芽試驗(yàn)和貯藏試驗(yàn)，比較不同種子的休眠性、在不同貯藏環(huán)境中的衰退率和貯藏壽命，為水稻種質(zhì)資源的更新繁育和安全保藏提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及干燥處理

由于每一個(gè)品種的種子都需要在每一個(gè)溫度和種子含水量組成的貯藏試驗(yàn)環(huán)境條件下至少測(cè)得3對(duì)發(fā)芽率和對(duì)應(yīng)貯藏時(shí)間的數(shù)據(jù)，即至少進(jìn)行3次發(fā)芽試驗(yàn)，每次發(fā)芽重復(fù)3次，以每個(gè)重復(fù)50粒計(jì)，9個(gè)環(huán)境共需種子4 000多粒，以每千粒25 g計(jì)，相當(dāng)于每一個(gè)品種至少需要100 g以上種子。因此，選用的參試水稻品種鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)、云恢188和沾粳9號(hào)等4份粳稻和1份秈稻云紫一號(hào)(表1)是在2013年7月入庫后，剩余種子量大于200 g的品種。和同期入庫的其他225個(gè)品種一樣，這些種子都是2012年晚稻季節(jié)在云南省西雙版納傣族自治州景洪市繁殖，2013年5月中旬送交種質(zhì)庫，然后在25～35 ℃、相對(duì)濕度15%～25%干燥室條件下處理40 d(約8 h/d)。

1.2 種子貯藏及發(fā)芽試驗(yàn)

首先，采用農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543—1995)測(cè)定參試品種的種子含水量(W1)和初始發(fā)芽率(IGP，表1)，然后分成3份。第1份再分成20～36份，每份300～400粒，分別密封在10 cm×15 cm的鋁箔袋內(nèi)，放在-5～-10 ℃的種質(zhì)庫內(nèi)保存待用。第2份置于上述干燥室條件下繼續(xù)脫水處理約15 d，使其含水量(W2)比W1低。第3份被裝于牛皮紙袋，平鋪于室內(nèi)地面15 d，其間每2～3 d翻動(dòng)1次，使其含水量(W3)比W1高。待第2、第3份種子處理結(jié)束并測(cè)定其含水量W2和W3后，也分成20～36份，分別密封在上述鋁箔袋內(nèi)待用。

種子貯藏試驗(yàn)開始于2013年11月1日。首先，將事先密封好的含水量為W1、W2和W3的種子，以6～12小袋為1組，分別置入溫度為30、40、50 ℃的恒溫箱內(nèi)保藏。然后，貯藏至第15天開始，依據(jù)不同溫度和種子含水量組成的貯藏試驗(yàn)環(huán)境，分別從中取出1小袋種子，按照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543—1995)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每重復(fù)100粒，共重復(fù) 3～4次，記錄從貯藏試驗(yàn)開始至發(fā)芽試驗(yàn)當(dāng)日的貯藏時(shí)間(d)。具體為貯藏在環(huán)境6～9的種子間隔7～15 d，環(huán)境3～5的種子間隔15～30 d，環(huán)境1和環(huán)境2的種子間隔 30～90 d，做1次發(fā)芽試驗(yàn)。當(dāng)某個(gè)環(huán)境下的某品種種子在連續(xù)2次發(fā)芽試驗(yàn)中的平均發(fā)芽率都為0或者種子被耗盡時(shí)，該品種在這個(gè)環(huán)境下的貯藏試驗(yàn)便結(jié)束(2016年8月1日)。在所有種子的貯藏試驗(yàn)結(jié)束后，整理獲得的種子發(fā)芽率及對(duì)應(yīng)貯藏時(shí)間的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境6(溫度40 ℃、種子含水量11.4%～11.6%)下，除獲得云恢188和云紫一號(hào)的3對(duì)有效數(shù)據(jù)外，沒有采集到另3個(gè)品種的有用數(shù)據(jù)，也沒有在環(huán)境9(溫度 50 ℃、種子含水量11.4%～12.3%)下獲得任何參試材料的數(shù)據(jù)(表1)。

1.3 貯藏試驗(yàn)環(huán)境導(dǎo)致死亡的種子比率

一般而言，在新收獲的種子中，不發(fā)芽的種子通常包括發(fā)育不全、破碎、霉變等以及有休眠的種子。因此，新收獲的種子在一定環(huán)境條件下保存一段時(shí)間后，出現(xiàn)的死亡率應(yīng)為貯藏后不發(fā)芽的種子比率減貯藏前不發(fā)芽的種子比率，也就是貯藏前的種子發(fā)芽率減貯藏后的種子發(fā)芽率。如果種子在貯藏后的發(fā)芽率比貯藏前的發(fā)芽率還要高，則將其死亡率記為0。因?yàn)?，一些休眠的種子可能在貯藏后解除了休眠。

1.4 種子衰退率和貯藏壽命估算與其存活、死亡曲線繪制

對(duì)于每一個(gè)貯藏環(huán)境，用IBM SPSS statistics 19的線性回歸分析模型擬合種子的發(fā)芽率、死亡率對(duì)貯藏時(shí)間的線性回歸方程，得到種子的衰退率。然后，由方程估算出表示種子貯藏壽命的半活期和半死期，后者是種子死亡率達(dá)到50%的貯藏時(shí)間(d)。另外，用Origin Pro 8的Nonlinear Curve Fit繪制種子的發(fā)芽率對(duì)貯藏時(shí)間的存活曲線及死亡率對(duì)貯藏時(shí)間的死亡曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種種子的發(fā)芽率比較

貯藏試驗(yàn)開始前，鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)、沾粳9號(hào)、云恢188和云紫一號(hào)種子的初始發(fā)芽率依次為73%、74%、88%、94%和92%。按原國際植物遺傳資源委員會(huì)推薦的種質(zhì)資源更新繁殖的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)(低于80%)[4]和判斷種子休眠性的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)(低于80%)，前2個(gè)品種的種子屬于發(fā)芽力低且有休眠的種子，后3個(gè)則屬于高發(fā)芽力無休眠的種子(表1)。

貯藏試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大多數(shù)環(huán)境下種子的發(fā)芽率都有明顯下降，但處在環(huán)境1和環(huán)境2下的沾粳9號(hào)、云恢188和云紫一號(hào)仍保持著86%～92%的發(fā)芽率(表1)，與初始發(fā)芽率(IGP)相比，幾乎沒有降低。不僅如此，這些品種在一些環(huán)境中的最大發(fā)芽率比IGP還略有提高。例如，沾粳9號(hào)在環(huán)境1、環(huán)境2、環(huán)境4中的最大發(fā)芽率較IGP分別提高了6、5、3百分點(diǎn)；云恢188在環(huán)境1～5及環(huán)境7中的最大發(fā)芽率保持在96%以上，較94%的IGP提高了2～5百分點(diǎn)；云紫一號(hào)在環(huán)境1、環(huán)境2的最大發(fā)芽率也比IGP增加了2百分點(diǎn)。但是，較IGP增加最多的是2個(gè)具有休眠性的鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)的種子。鳳稻20號(hào)在環(huán)境1中的最大發(fā)芽率為85%，較IPG增加了12百分點(diǎn)；合系22號(hào)在環(huán)境2中的最大發(fā)芽率也較IGP提高了13百分點(diǎn)。

因此，不只是有休眠的種子才在相對(duì)低的貯藏溫度和種子含水量形成的貯藏試驗(yàn)環(huán)境下有發(fā)芽率較IGP更高的現(xiàn)象，無休眠的種子也有類似現(xiàn)象發(fā)生。當(dāng)然，休眠種子的發(fā)芽率上升的空間或幅度比無休眠種子的更大。

表1 參試材料的初始發(fā)芽率、貯藏環(huán)境和采集到的發(fā)芽率與對(duì)應(yīng)的貯藏時(shí)間

2.2 不同品種種子在貯藏過程中的衰退率差異

已有研究表明，種子生活力的衰退不是等速下降的，是呈現(xiàn)前慢中快后慢的反“S”形。分析由IBM SPSS statistics 19擬合的種子發(fā)芽率(y)對(duì)貯藏時(shí)間(x)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)的線性回歸方程(表2)，發(fā)現(xiàn)表示種子衰退率的回歸系數(shù)在不同品種及貯藏環(huán)境之間有明顯的差異。在環(huán)境3(貯藏溫度30 ℃和種子含水量11.4%～12.3%，下同)下，除沾粳9號(hào)外，鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)種子的衰退率是云恢188和云紫一號(hào)種子的2.5倍以上。在環(huán)境4和環(huán)境5(40 ℃和7.8%～8.7%)下，鳳稻20號(hào)種子的衰退率是云恢188和云紫一號(hào)的1.4～4倍。在環(huán)境7(50 ℃和7.6%～8.5%)中，鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)種子的衰退率是云恢188和云紫一號(hào)的1.3倍。

在種子死亡率(y)對(duì)貯藏時(shí)間(x)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的方程中，種子衰退率也有上述類似的變化。在環(huán)境3中，鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)種子的衰退率是云恢188、云紫一號(hào)的2.7～2.9倍。在環(huán)境4和環(huán)境5中，鳳稻20號(hào)種子的衰退率是云恢188、云紫一號(hào)的2～4倍。在環(huán)境7中，鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)種子的衰退率是云恢188、云紫一號(hào)的1.3倍以上。

另外，比較曲線圖(圖1)發(fā)現(xiàn)，鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)種子的曲線，比沾粳9號(hào)、云恢188和云紫一號(hào)種子的曲線少了一段發(fā)芽率緩慢下降或者死亡率緩慢上升的過程。前二者種子發(fā)芽率或死亡率幾乎是從貯藏試驗(yàn)一開始就呈直線下降或上升的過程。所以，IGP低或種子具有休眠性的鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)的種子比無休眠而IGP高的種子生活力衰減更快。

2.3 不同品種種子的貯藏壽命差異

由表2可知，由具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的回歸方程估算出的表示種子壽命的半活期(xgp50)和半死期(xdp50)，在相同貯藏環(huán)境的不同品種和不同環(huán)境的相同品種之間也很大的差異。

半活期：在環(huán)境3中，鳳稻20號(hào)種子的半活期最短，為38 d，合系22號(hào)75 d，沾粳9號(hào)94 d，云恢188和云紫一號(hào)的最長，分別為209 d和226 d。在環(huán)境4和環(huán)境5中，鳳稻20號(hào)最短，為96 d和66 d，合系22號(hào)為200 d和143 d，沾粳9號(hào)為176 d和55 d，云恢188為438 d和332 d，云紫一號(hào)為253 d和261 d。在環(huán)境7下，鳳稻20號(hào)最短，為17 d，合系22號(hào)和沾粳9號(hào)分別為40 d和58 d，云恢188和云紫一號(hào)都是96 d。

表2 參試品種在不同貯藏環(huán)境下的衰退率和貯藏壽命

半死期：在環(huán)境3中，鳳稻20號(hào)種子的半死期最短，為72 d，合系22號(hào)和沾粳9號(hào)為108 d和110 d，云恢188和紫一號(hào)的最長，分別是229 d和255 d。在環(huán)境4和環(huán)境5下，鳳稻20號(hào)最短，為185 d和101 d；合系22號(hào)為253 d，云恢188最長，為481 d和365 d；云紫一號(hào)為284 d和296 d。在環(huán)境7中，鳳稻20號(hào)最短，為50 d，合系22號(hào)和沾粳9號(hào)為 65 d，云恢188和云紫一號(hào)最長，為104 d和107 d。

所以，有休眠的鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)的種子貯藏壽命，相對(duì)于無休眠的云恢188、云紫一號(hào)的種子貯藏壽命要短很多。

3 討論與結(jié)論

3.1 發(fā)芽率與種子休眠

正常成熟并收獲一定時(shí)間的種子，除機(jī)械損傷、病蟲侵蝕等外，表現(xiàn)出的低發(fā)芽現(xiàn)象大多與種子本身的休眠有關(guān)。而具有休眠特性的水稻[9-10]、小麥[11-12]和裸大麥[13]等作物，對(duì)收獲前的穗發(fā)芽(pre-harvest sprouting，PHS)抗性是有利的。本研究對(duì)5個(gè)水稻品種種子在貯藏試驗(yàn)開始前的初始發(fā)芽率(IGP)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)鳳稻20號(hào)、合系22號(hào)種子的IGP都在80%以下。但在一定貯藏環(huán)境下保存一段時(shí)間后，其發(fā)芽率又可高達(dá)80%以上，證明這些種子中存在相當(dāng)部分的休眠種子。所以，這2個(gè)品種可能是研究和選育穗發(fā)芽抗性品種的有用基因資源。另外，貯藏后的種子發(fā)芽率比貯藏前的更高，這種現(xiàn)象在IGP更高的沾粳9號(hào)、云恢188、云紫一號(hào)及普通小麥[14]的種子中也有發(fā)現(xiàn)。所以，種子的休眠現(xiàn)象不僅存在于發(fā)芽力低的品種，也出現(xiàn)在發(fā)芽力高的品種當(dāng)中，是普遍存在的[15-17]。

3.2 種子的衰退模型、衰退率和貯藏壽命

據(jù)研究，經(jīng)過(45±1) ℃老化的水稻種子[18]，含水量為4%、5%、6%、7%、8%和10.6%，在哈爾濱(年均溫 5.3 ℃，>0 ℃的年有效積溫3 202.5 ℃)、西寧(年均溫6 ℃，>0 ℃年有效積溫2 745.9 ℃)、烏魯木齊(年均溫7.8 ℃，>0 ℃年有效積溫3 540.2 ℃)、北京(年均溫13.2 ℃，>0 ℃年有效積溫4 118.1 ℃)、南昌(年均溫18.5 ℃，>0 ℃年有效積溫 6 410.2 ℃)和三亞(年均溫26.2 ℃，>0 ℃年有效積溫 8 074.3 ℃)等地區(qū)室溫下貯藏14年后的水稻種子[19]；含水量為10.6%、5%和3%在三亞和南昌2地貯藏后的水稻種子[20]，其存活曲線都是呈反“S”形的。本研究在30、40、50 ℃及種子含水量為7.6%～12.3%的貯藏環(huán)境條件下，獲得的種子存活曲線也同樣呈反“S”形，而種子死亡曲線因種子的死亡率是發(fā)芽率的反函數(shù)而呈“S”形。

鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)的種子比云恢188和云紫一號(hào)種子的生活力衰退快、貯藏壽命短，與這2個(gè)品種種子的低發(fā)芽力和休眠性有關(guān)。研究表明，發(fā)芽力高的種子，其生命力開始衰減是從1個(gè)發(fā)芽率緩慢下降的第一階段或平臺(tái)期[21]開始的，而發(fā)芽力低的種子則是從發(fā)芽率快速下降的第2階段開始的。因此，鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)種子的發(fā)芽率從貯藏試驗(yàn)一開始幾乎就是直線下降的，而沒有沾粳9號(hào)、云恢188和云紫一號(hào)那樣的緩慢下降階段。這可能是休眠或低發(fā)芽種子比無休眠、高發(fā)芽種子的生活力衰退更快、貯藏壽命更短的主要原因。

3.3 種子的半活期和半死期

半活期是種子發(fā)芽率下降至50%的貯藏時(shí)間，適合用于預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)高生活力而不是低生活力的種子的貯藏壽命[4]。因此，Mead等對(duì)Ellis等建立的生存力模型[4]進(jìn)行了修改[22]，提出了-1(%viability/100)=A+Bt的模型。在該模型中，-1(%viability/100)是有生存能力的種子比率的反函數(shù)，t為貯藏時(shí)間。本研究定義和計(jì)算的種子死亡率，實(shí)際上是發(fā)芽率的反函數(shù)，相當(dāng)于-1(%viability/100)。

表2中，半死期總比半活期大，其差值(xdp50-xgp50)也是鳳稻20號(hào)和合系22號(hào)的較大，沾粳9號(hào)、云恢188和云紫一號(hào)的較小。例如，在環(huán)境3中鳳稻20號(hào)為33.7 d，合系22號(hào)為32.6 d，沾粳9號(hào)為16.2 d，云恢188為19.7 d，云紫一號(hào)為 29 d；在環(huán)境7中鳳稻20號(hào)為33 d，合系22號(hào)為25 d，沾粳9號(hào)為7.4 d，云恢188為7.3 d，云紫一號(hào)為10.2 d。因此，有種子的初始發(fā)率低，差值大，初始發(fā)芽率高，差值小的趨勢(shì)。說明對(duì)半活期的估算受休眠種子的影響較大，對(duì)于有休眠的種子，用半死期比用半活期表示其壽命更準(zhǔn)確一些，而對(duì)于無休眠或者高發(fā)芽力的種子，半死期或半活期均可較好地表示其壽命。