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        枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR分布特征分析及其與基因組SSR分布特征的比較

        2018-08-08 08:07:18張得芳樊光輝王占林
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年14期
        關(guān)鍵詞:基序微衛(wèi)星堿基

        虞 杭,張得芳,2,樊光輝,2,王占林,2

        (1.青海大學(xué),青海西寧 810016; 2.青海省農(nóng)林科學(xué)院/青海高原林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016)

        枸杞(Lyciumbarbarum)屬于茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)落葉灌木,是重要的藥用資源,其果、葉、根等均能被利用,在中藥配方中有重要地位[1-2]。枸杞的營(yíng)養(yǎng)含量非常豐富,富含蛋白質(zhì)、維生素和多種氨基酸,還有類(lèi)胡蘿卜素以及鈣、鐵、鋅、硒等對(duì)人體有益的元素,有很高的藥用價(jià)值和保健效果。枸杞不僅有美容養(yǎng)生和抗衰老的功效,還具有抗癌、降血糖、降血脂以及護(hù)眼等功能[3-7]。

        轉(zhuǎn)錄組是指某個(gè)物種或細(xì)胞在某一條件下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合。RNA-Seq技術(shù)能夠在單核苷酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè),以提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息[8-12]。同樣,RNA-Seq技術(shù)的應(yīng)用也非常普遍,利用此技術(shù)鑒定油菜(BrassicacampestrisL.)葉片干旱脅迫應(yīng)答相關(guān)基因,從轉(zhuǎn)錄組水平揭示油菜適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境的分子機(jī)制[13];在果樹(shù)學(xué)中通過(guò)追蹤柑橘(CitrusreticulataBlanco)、葡萄(VitisviniferaL.)、香蕉(MusananaLour.)等10個(gè)常見(jiàn)果樹(shù)的RNA-Seq實(shí)例,研究具體應(yīng)用進(jìn)展[14];在地道藥材形成機(jī)制研究以及改善牦?;蚪Y(jié)構(gòu)信息上也起到了至關(guān)重要的作用[15]。

        簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,簡(jiǎn)稱(chēng)SSR)又稱(chēng)微衛(wèi)星,是核苷酸串聯(lián)重復(fù)單元(1~6個(gè)核苷酸),在真核及原核生物基因組中都有分布,SSR標(biāo)記可分為表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)和基因組SSR[16-22]。此標(biāo)記技術(shù)具有高多態(tài)性、高重復(fù)性和較廣的覆蓋面等特點(diǎn),目前在構(gòu)建植物的遺傳圖譜、分析遺傳多態(tài)性上有較普遍的應(yīng)用,對(duì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)和種質(zhì)鑒定也起到了很大的幫助[17,23-25]。EST-SSR是在已有EST序列的基礎(chǔ)上,用電子篩選鑒別SSR,再用PCR檢測(cè),避免了SSR引物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的克隆和測(cè)序步驟,很好地利用了現(xiàn)有數(shù)據(jù),節(jié)約了開(kāi)發(fā)成本[26]。

        本研究對(duì)枸杞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)對(duì)不同基因序列長(zhǎng)度類(lèi)型微衛(wèi)星的統(tǒng)計(jì)與分析,了解枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR的特征及組成,并將其與基因組SSR進(jìn)行分析比較,從而進(jìn)一步了解枸杞基因組SSR和轉(zhuǎn)錄組SSR在分布特征上的變化規(guī)律。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        2015年春天在青海省林業(yè)科學(xué)研究所枸杞種質(zhì)資源圃,采集青杞1號(hào)的新梢頂端剛長(zhǎng)出的幼葉作為試驗(yàn)材料,采集葉片后立即放入液氮罐冷凍并帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80 ℃冰箱中。

        1.2 RNA提取

        采用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取總RNA,按照試劑盒要求進(jìn)行操作。

        1.3 構(gòu)建文庫(kù)及上機(jī)測(cè)序

        用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,然后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段,以mRNA為模板,用6堿基隨機(jī)引物合成第1鏈cDNA,然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymeraseⅠ、RNase H合成第2鏈cDNA,再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。將處理后的cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭,再用AMPure XP beads進(jìn)行選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并用AMPure XP beads純化產(chǎn)物,得到最終的文庫(kù)。把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina HiSeq測(cè)序。

        1.4 分析方法

        利用Misa軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SSR查找,從較短的表達(dá)序列標(biāo)簽中挖掘SSR標(biāo)記位點(diǎn),識(shí)別SSR的重復(fù)單元并找尋其側(cè)翼序列,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析[27]。其中參數(shù)設(shè)定為:1~6堿基重復(fù)最短的重復(fù)數(shù),依次為10、6、5、5、5、5個(gè)重復(fù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 枸杞轉(zhuǎn)錄組與基因組微衛(wèi)星豐度及分布密度分析

        在本次測(cè)序結(jié)果中,對(duì)枸杞轉(zhuǎn)錄組多堿基重復(fù)的微衛(wèi)星進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2堿基重復(fù)單元和3堿基重復(fù)單元的SSR含量最多,分別占SSR統(tǒng)計(jì)總數(shù)的49.27%、48.22%,之后依次是4堿基重復(fù)(2.18%)、5堿基重復(fù)(0.18%)、6堿基重復(fù)(0.15%)。含有66種不同重復(fù)堿基組成的2堿基重復(fù)微衛(wèi)星,還有由不同重復(fù)堿基組成的3堿基、4堿基、5堿基、6堿基重復(fù)微衛(wèi)星,分別有188、59、9、8種。通過(guò)對(duì)測(cè)得的低覆蓋度的枸杞轉(zhuǎn)錄組的序列進(jìn)行微衛(wèi)星查找,從總長(zhǎng)為75 398 046 bp的 111 921 個(gè)重疊中共查找出5 411個(gè)SSR;而基因組中SSR含量最多的是3堿基重復(fù)單元,約占SSR統(tǒng)計(jì)總數(shù)的66.51%。對(duì)測(cè)得基因組的序列進(jìn)行微衛(wèi)星查找,從總長(zhǎng)為 260 163 757 bp 的880 315個(gè)重疊中共查找出14 733個(gè)SSR[28]。利用微衛(wèi)星密度公式計(jì)算得,轉(zhuǎn)錄組平均每 13 934.2 bp 出現(xiàn)1個(gè)SSR,而基因組平均每17 658.6 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR[28]。

        2.2 枸杞轉(zhuǎn)錄組與基因組微衛(wèi)星優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元類(lèi)型堿基構(gòu)成

        由圖1可知,轉(zhuǎn)錄組中在66種2堿基重復(fù)單元中,AG/CT基序的數(shù)量最多,共1 285個(gè),占48.20%,其次是AT/AT共845個(gè),占31.70%;AC/GT共531個(gè),占19.92%;CG/CG共5個(gè),占0.19%。

        由圖2可知,在188種3堿基重復(fù)單元中,AAC/GTT基序的數(shù)量最多,共690個(gè),占26.44%,其次是AAG/CTT,共675個(gè),占25.87%;ATC/ATG共345個(gè),占13.22%;AAT/ATT共340個(gè),占13.03%;ACC/GGT共185個(gè),占7.10%;其余3堿基重復(fù)單元數(shù)量均較少。

        由圖3可知,59種4堿基重復(fù)單元中,重復(fù)類(lèi)型數(shù)量最大的基序?yàn)锳AAT/ATTT,共35個(gè),占29.66%,其次主要是AAAG/CTTT共34個(gè),占28.81%;AAAC/GTTT共20個(gè),占16.95%。

        由圖4可知,5堿基重復(fù)單元中,AAAAG/CTTTT共2個(gè),占20%,其余均為1個(gè),各占10%。

        由圖5可知,6堿基重復(fù)單元中的基序均為1個(gè),各占12.50%。

        綜合分析,轉(zhuǎn)錄組中2堿基重復(fù)數(shù)量最多,其次是3堿基重復(fù),其中2堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)序列為AG/CT、AT/AT,而6堿基重復(fù)豐度最低。

        基因組中,在2堿基重復(fù)微衛(wèi)星中AT/TA基序重復(fù)的數(shù)量最多,共1 806個(gè),占44.7%;在61種3堿基重復(fù)單元中,GTT/CAA基序的數(shù)量最多,共2 744個(gè),占28.0%,其次是ACA共738個(gè),占7.5%;ATC共709個(gè),占7.2%;AAC共483個(gè),占4.9%;ATG共427個(gè),占4.4%;其余3堿基重復(fù)單元數(shù)量均較少[28]。

        綜合分析,基因組中3堿基重復(fù)數(shù)量最多,2堿基重復(fù)數(shù)量?jī)H次于3堿基重復(fù),其中3堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)序列為GTT/CAA、ACA、ATC;同樣6堿基重復(fù)豐度最低。

        經(jīng)計(jì)算得,枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR的平均長(zhǎng)度為16.19 bp,最長(zhǎng)為62 bp,最短為12 bp,其中主要以12~18 bp的微衛(wèi)星為主,占總數(shù)的81.76%,長(zhǎng)度>18 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的 18.24%。枸杞基因組SSR的平均長(zhǎng)度為13.81 bp,最長(zhǎng)為36 bp,最短為12 bp。其中主要以12~14 bp的微衛(wèi)星為主,占總數(shù)的64.80%。長(zhǎng)度>14 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的35.20%[28]。

        3 結(jié)論與討論

        經(jīng)測(cè)序分析,轉(zhuǎn)錄組中在總長(zhǎng)為75 398 046 bp的有效讀長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)有5 411個(gè)微衛(wèi)星分布,平均每13 934.2 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星;基因組中在總長(zhǎng)為260 163 757 bp的有效讀長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)有14 733個(gè)微衛(wèi)星分布,平均每17 658.6 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星[28]。轉(zhuǎn)錄組SSR和基因組SSR的分布存在明顯差異,轉(zhuǎn)錄組2堿基重復(fù)數(shù)量最多,而基因組中則是3堿基最豐富(表1)。并利用SSR密度計(jì)算公式D=N/L算出密度。式中:L代表重疊群總長(zhǎng)(Mb);N代表各重復(fù)微衛(wèi)星數(shù)量(個(gè));D代表不同重復(fù)微衛(wèi)星密度(個(gè)/Mb)。

        表1 轉(zhuǎn)錄組與基因組不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星所占比例及分布密度比較

        枸杞轉(zhuǎn)錄組平均每13 934.2 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星,分布密度為71.6個(gè)/Mb。2堿基重復(fù)數(shù)量最多,占總數(shù)的49.3%,其次3堿基重復(fù)數(shù)量與2堿基相近,占48.2%,其余重復(fù)所占比例均較少。2堿基重復(fù)單元中,基序數(shù)量從多到少分別為AG/CT、AT/AT、AC/GT;3堿基重復(fù)單元中分別為AAC/GTT、AAG/CTT、ATC/ATG等。與轉(zhuǎn)錄組相比,基因組平均 17 658.6 bp 出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星,分布密度為56.6個(gè)/Mb,小于轉(zhuǎn)錄組分布密度?;蚪M中3堿基重復(fù)最為普遍,所占比例較大,為66.5%,其次是2堿基重復(fù),為27.4%,2、3堿基重復(fù)數(shù)量差距較大,其余重復(fù)所占比例均較小。2堿基重復(fù)單元中,基序數(shù)量較多的分別為AT/TA、GT/TA、AC/CA;3堿基重復(fù)單元中分別為GTT/CAA、ACA、ATC等。轉(zhuǎn)錄組SSR與基因組SSR分布特征差異較大,轉(zhuǎn)錄組中2堿基重復(fù)數(shù)量最多,而基因組中則是3堿基重復(fù)數(shù)量最多,基因組基序數(shù)量與種類(lèi)也與轉(zhuǎn)錄組存在顯著差異。

        同為茄科植物的辣椒(CapsicumannuumL.),從轉(zhuǎn)錄組SSR上看,不考慮單堿基重復(fù),2、3堿基重復(fù)分別占19.16%、23.18%,堿基重復(fù)數(shù)量相近,其余重復(fù)占很小比例。2堿基重復(fù)單元中以AG/CT基序數(shù)量最多,占58.02%;3堿基重復(fù)單元中以AAC/GTT基序數(shù)量最多,占27.8%[29]。辣椒基因組SSR基序中2、3堿基重復(fù)分別占22.59%、29.01%,AT/AT、AAT/ATT分別是2堿基和3堿基重復(fù)單元中數(shù)量最多的基序。由此可見(jiàn)辣椒轉(zhuǎn)錄組SSR與基因組SSR分布特征較為類(lèi)似,2、3堿基的重復(fù)數(shù)量都較為接近,且3堿基重復(fù)略多于2堿基重復(fù)[30]。

        茄科的另一物種馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)與上述2種植物的SSR分布特征又有不同。馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組SSR,以寧薯4號(hào)為例,SSR重復(fù)類(lèi)型從2核苷酸重復(fù)到9核苷酸重復(fù)均有,其中3堿基重復(fù)為主要的重復(fù)類(lèi)型,占58.2%,其次是6堿基重復(fù)和2堿基重復(fù),分別占12.8%、10.7%,3堿基重復(fù)單元中GAA/TTC基序出現(xiàn)的次數(shù)最多,占7%[31]。在基因組SSR中,單堿基重復(fù)、2堿基重復(fù)、3堿基重復(fù)這3種重復(fù)類(lèi)型占總SSR位點(diǎn)的94.16%,而4~6堿基重復(fù)占 1.24%[32]??梢?jiàn)馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組SSR與基因組SSR無(wú)論是重復(fù)的堿基類(lèi)型還是主要重復(fù)類(lèi)型都存在較大差異。

        有研究發(fā)現(xiàn),單堿基重復(fù)和2堿基重復(fù)類(lèi)型的SSR大多位于非編碼區(qū),而有部分3堿基重復(fù)類(lèi)型位于編碼區(qū),在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),基因組SSR中,3堿基重復(fù)類(lèi)型要明顯多于2堿基重復(fù)類(lèi)型。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序是通過(guò)對(duì)基因組特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序來(lái)反映部分基因組序列結(jié)構(gòu)信息的測(cè)序技術(shù),而表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)中SSR結(jié)構(gòu)及分布廣,不僅可以存在于內(nèi)含子,也存在于編碼區(qū)、非編碼區(qū)和調(diào)控區(qū),數(shù)量龐大的SSR在基因組中分布均勻,可代表整個(gè)基因組??梢?jiàn)在轉(zhuǎn)錄組SSR中2、3堿基重復(fù)所占比例較大,而且重復(fù)數(shù)量相近。

        根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果分析表明,枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR與基因組SSR分布在主要堿基重復(fù)類(lèi)型上和主要的基序數(shù)量上都存在較顯著差異,基因組序列能夠幫助轉(zhuǎn)錄組注釋數(shù)據(jù),而轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也可對(duì)校正基因組注釋信息和發(fā)現(xiàn)新基因起到幫助,可為研究枸杞性狀及多態(tài)性提供參考依據(jù)。

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