（四川省醫(yī)院科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川 成都 610072）

鐘佳伶 王甲甲 魯代強(qiáng) 杜瓊 黃文芳（通訊作者）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其良好的特異性和靈敏度，以及操作簡(jiǎn)便，被廣泛用于病毒的定量檢測(cè)。病毒定量結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響臨床醫(yī)生的診治[1-2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀作為檢測(cè)系統(tǒng)中的重要組成部分，對(duì)其性能進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義。AFD9600是由杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。本文從精密度、正確度、線性及檢測(cè)下限方面對(duì)其性能進(jìn)行了驗(yàn)證。

1.材料和方法

1.1 材料

主要儀器：AFD9600實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（中國(guó)杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司），低溫高速離心機(jī)，金屬浴等。儀器設(shè)備均在校準(zhǔn)效期內(nèi)。試劑：HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎㄖ袊?guó)達(dá)安基因公司）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：北京康徹思坦公司（GBW(E)090137、 GBW(E)090138、 GBW(E)090139）。檢測(cè)標(biāo)本：臨床中收集的患者新鮮血清。所有標(biāo)本均于-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 精密度驗(yàn)證 按照CLSI制定的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)EP15-A2[3]要求進(jìn)行分析。收集非脂血、非溶血的低、高值兩個(gè)水平的患者血清，每天檢測(cè)一個(gè)批次，每水平重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)測(cè)定4天，計(jì)算批內(nèi)精密度（CV批內(nèi)）和總精密度（CV總）。按照CNASCL36[4]中要求，以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)的評(píng)價(jià)界限（靶值±0.4對(duì)數(shù)值）作為允許總誤差(TEa)，重復(fù)性精密度＜3/5TEa，中間精密度小于＜4/5TEa為符合要求。

1.2.2 正確度驗(yàn)證 使用3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證。每個(gè)測(cè)定3次，計(jì)算平均值與靶值的相對(duì)偏倚。按衛(wèi)生部臨檢中心HBV-DNA定量的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)，偏倚＜7.5%為驗(yàn)證通過(guò)。

1.2.3 線性范圍驗(yàn)證 收集臨床HBV-DNA高值標(biāo)本，用陰性血清梯度稀釋（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶1000000）。每個(gè)濃度檢測(cè)2次，取平均值與預(yù)期值相比較，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)。r＞0.98為符合要求。

1.2.4 檢測(cè)下限驗(yàn)證 選取試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品（2.0×103IU/mL），用陰性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1.0×103IU/mL和5×102IU/mL。將標(biāo)本檢測(cè)10次，9次檢出為符合要求。

1.2.5 質(zhì)控 每次實(shí)驗(yàn)均做室內(nèi)質(zhì)控，質(zhì)控在控時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有定量數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用Excel2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

AFD9600檢測(cè)HBV-DNA低值和高值的CV批內(nèi)分別為1.6%和1.3%，CV總分別為2.1%和1.6%。按CNAS-CL36要求，檢測(cè)所得CV值均在允許范圍內(nèi)，驗(yàn)證合格（見表1）。

表1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.2 正確度驗(yàn)證

三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果分別為1.84×103IU/mL、5.24×104IU/mL、5.40×106IU/mL。結(jié)果顯示偏倚均小于7.5%，驗(yàn)證合格（見表2）。

表2 正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 線性范圍驗(yàn)證

臨床中收集到的HBV-DNA高值標(biāo)本定量為2.30×108IU/mL，梯度稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)值與理論值的直線回歸方程為Y= 0.9937X-0.0697，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9992，驗(yàn)證通過(guò)（見表3、圖1）。

表3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

圖1 線性范圍驗(yàn)證回歸曲線

2.4 檢測(cè)下限驗(yàn)證

稀釋至1.0×103IU/mL和5×102IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行10次檢測(cè)。濃度1×103IU/mL及5×102IU/mL的檢出率均為100%，CV分別為3.45%、5.97%（見表4）。

表4 檢測(cè)下限驗(yàn)證

3.討論

隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的推廣和應(yīng)用，越來(lái)越多的國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀現(xiàn)身于臨床實(shí)驗(yàn)室中。安杰思AFD9600是由杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)的96孔實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)，其以鹵素?zé)糇鳛楣庠?，?個(gè)檢測(cè)通道，激發(fā)光波長(zhǎng)在400～800nm。檢測(cè)時(shí)，激發(fā)光通過(guò)光纖直接照射樣品，產(chǎn)生的熒光發(fā)射信號(hào)通過(guò)光纖、濾光片和透鏡抵達(dá)冷態(tài)CCD照相機(jī)，完成信號(hào)采集，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

ISO15189[5]規(guī)定，儀器必須進(jìn)行相關(guān)的性能驗(yàn)證，才能投入臨床使用。本研究依據(jù)CNAS-CL36和CLSI要求，對(duì)AFD9600的性能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，低值和高值的CV批內(nèi)分別為1.6%和1.3%，CV總分別為2.1%和1.6%，符合衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)及廠家聲明。正確度驗(yàn)證結(jié)果顯示，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果偏倚在-1.05%～3.49%，均在可接受范圍內(nèi)。線性范圍驗(yàn)證結(jié)果顯示，其線性范圍線性可覆蓋102～108IU/mL，涵蓋了絕大多數(shù)陽(yáng)性標(biāo)本濃度范圍，相關(guān)系數(shù)為0.9992，線性關(guān)系良好。靈敏度的驗(yàn)證結(jié)果顯示，其靈敏度可達(dá)到5×102IU/mL，滿足臨床需求。

綜上所述，AFD9600型實(shí)時(shí)熒光定量PRC儀的正確度、精密度、線性范圍、靈敏度均達(dá)到衛(wèi)生部的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，滿足臨床需要，能夠在臨床分子生物實(shí)驗(yàn)室投入使用。

[1]Berger A,Preiser W.Viral genome quantification as a tool for improving patient management:the example of HIV, HBV, HCV and CMV[J].J Antimicrob Chemother,2002,49（5）:713-721.

[2]王鳳嵐，黃朝芳，馮萬(wàn)周.乙肝血清免疫標(biāo)志物及HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析及臨床應(yīng)用[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，11（3）：203-204.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).User verification of performance for precision and trueness;approved guideline—Second Edition Document EP15-A2[S].Wayne,PA.USA,2005.

[4]CNAS-CL36：2012.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明[S].中國(guó)合格評(píng)審國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2012.

[5]CNAS-CL02：2012.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].中國(guó)合格評(píng)審國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2013.