葉勵(lì)超

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 福建 泉州 362000）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是當(dāng)前臨床研究多發(fā)性硬化疾病的理想動(dòng)物模型，主要應(yīng)用同種的中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)抗原及其類似物誘導(dǎo)而成，其發(fā)病機(jī)理與病理表現(xiàn)均和多發(fā)性硬化相似，病變核心均為免疫反應(yīng)性炎癥。目前已有大量研究證實(shí)[1]，白介素-17、白介素-23在多發(fā)性硬化并發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。也有研究報(bào)道[2]，維生素D在體內(nèi)經(jīng)肝臟、腎臟羥化后可形成1-25二羥基維生素D，進(jìn)而起到免疫調(diào)節(jié)作用，適用于多發(fā)性硬化的防治。本研究擬建立維生素缺乏和補(bǔ)充的EAE小鼠模型，通過(guò)觀察EAE發(fā)病前期、急性進(jìn)展期和慢性期小鼠神經(jīng)功能、IL-17陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)差異，進(jìn)而探析維生素D對(duì)EAE小鼠病情進(jìn)展的影響。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌性6周齡，體質(zhì)量20～25g，共48只，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料與試劑

維D缺乏飼料（購(gòu)自江蘇特洛菲飼料公司），維生素D飼料自行制作（先將維生素D溶解于無(wú)水乙醇中，制備成1mg/ml的溶液備用，同時(shí)將瓊脂溶解于蒸餾水中制成1%的溶液經(jīng)加熱煮沸后加入不含有維生素D的合成飼料，攪拌均勻，并在瓊脂溶液完全凝固之前，將維生素D溶液加入并混勻，制備成含有維生素D的飼料）。維生素D（購(gòu)自上海生工），免抗小鼠IL-17多克隆抗體、山羊抗兔IgG（美國(guó)Sigma公司），完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司提），百日咳霉素（美國(guó)Sigma公司），MOG35-55（上海翊圣生物）等。

2.方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組方法

將48只小鼠隨機(jī)分6組，每組8只，其中，A組為維生素D缺乏組免疫10天，B組為維生素D缺乏組免疫16天，C組為維生素D缺乏組免疫30天，D組為小劑量維生素D組免疫10天，E組為小劑量維生素D組免疫16天，F(xiàn)組為小劑量維生素D組免疫30天。

表2 各組小鼠脊髓、大腦組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目對(duì)比（±s，個(gè)）

表2 各組小鼠脊髓、大腦組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目對(duì)比（±s，個(gè)）

A組 B組 C組 D組 E組 F組脊髓組織 201.93±25.61 236.12±22.38 213.47±19.05 117.79±18.03 160.50±19.11 143.47±23.46大腦組織 258.69±27.36 295.63±20.33 271.80±25.49 115.90±15.44 157.15±22.17 136.34±16.48

2.2 適應(yīng)性喂養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)小鼠自購(gòu)回后保持其自由飲水、進(jìn)食，溫度23～25℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2.3 維生素D缺乏干預(yù)處理

A、B、C組則喂食維生素D缺乏飼料；D、E、F組按200IU/只/天（5g/只/天）的量喂食維生素D飼料。每隔一天喂一次，共持續(xù)四周。

2.4 MOG35-55乳劑制備

用PBS緩沖液將MOG35-55稀釋為0.5mg/ml，然后將稀釋液與等量的完全弗氏佐劑充分混合，通過(guò)三通管將乳劑抽打?yàn)橥耆桶疇顟B(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 EAE造模

實(shí)驗(yàn)鼠稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g），背部備皮，酒精棉球消毒后各小鼠分別于背部中線兩側(cè)皮下4點(diǎn)注射抗原乳劑0.2ml。免疫當(dāng)天（第0d）及48h（第2d）分別給模型各組小鼠腹腔注射百日咳霉素每只500ng（0.2ml），誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生EAE。

2.6 小鼠一般狀態(tài)以及神經(jīng)功能觀察

自免疫當(dāng)天開(kāi)始，每天對(duì)6組小鼠的精神狀態(tài)、毛色、糞便等一般狀況進(jìn)行觀察，并采用Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]評(píng)估小鼠的神經(jīng)功能，具體為：0分：無(wú)任何臨床癥狀出現(xiàn)；1分：小鼠尾部不能上抬。無(wú)張力，見(jiàn)步態(tài)輕度笨拙；2分：小鼠雙后肢均無(wú)力，但在被動(dòng)翻身后可自行恢復(fù)；3分：小鼠雙后肢均癱瘓無(wú)力，被動(dòng)翻身后也無(wú)法自行恢復(fù)；4分：小鼠雙后肢已癱瘓，前肢肌力有所減弱，伴大小便失禁；5分：小鼠瀕臨死亡。

2.7 病理學(xué)檢查

對(duì)各組實(shí)驗(yàn)鼠稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g），剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，注射針頭插入左心室，剪開(kāi)右心耳，注入PBS緩沖液，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛溶液固定樣本組織，取出脊髓與大腦組織，4%多聚甲醛固定用于石蠟包埋。用切片機(jī)將石蠟包埋進(jìn)行切片，每只小鼠的脊髓、大腦組織取3張切片，隨后采用蘇木精-伊紅染色，以免抗小鼠IL-17多克隆抗體為一抗，山羊抗兔IgG作為二抗，嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)說(shuō)明書進(jìn)行操作，并在光學(xué)顯微鏡下對(duì)每張切片進(jìn)行觀察，每個(gè)切片選擇3個(gè)視野記錄細(xì)胞核完整的免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS22.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組組間比較用方差分析，P＜0.05為差異顯著。

3.結(jié)果

3.1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

D、E、F組的神經(jīng)功能評(píng)分均較A、B、C組明顯降低（F=25.695，P=0.000），且D組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于E、F組（F=4.433，P=0.025），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（±s，分）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（±s，分）

A組 B組 C組 D組 E組 F組2.23±0.57 3.12±0.78 2.67±0.82 11.01±0.29 1.68±0.721.19±0.5

3.2 各組小鼠脊髓、大腦組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目對(duì)比

D、E、F組脊髓組織、大腦組織的IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯 著 少 于 A、B、C組（F脊 髓 =133.017，P=0.000；F大 腦=415.283，P=0.000），且D組小鼠脊髓、大腦組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較E、F組明顯減少（F脊髓=30.072，P=0.000；F大腦=58.710，P=0.000），見(jiàn)表 2。

3.討論

有研究報(bào)道[4]，多發(fā)性硬化的發(fā)病主要與遺傳、環(huán)境、病毒感染以及免疫異常等因素密切相關(guān)，且隨著對(duì)本病研究的不斷深入，IL-17在多發(fā)性硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制受到了重視。王利娟的研究也指出[5]，多發(fā)性硬化患者血清中的IL-17表達(dá)水平較健康者明顯升高，且與慢性期相比，急性進(jìn)展期的IL-17表達(dá)水平要高于其3.5倍，這可在一定程度上說(shuō)明血清中IL-17水平與多發(fā)性硬化病情嚴(yán)重程度具有一定的相關(guān)性。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[6]，EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有大量IL-17，該物質(zhì)所產(chǎn)生的特異性T淋巴細(xì)胞可加快EAE的病程，提示IL-17可在EAE發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。在本研究中，分別研究了免疫后10d、16d、30d（三個(gè)時(shí)間點(diǎn)），即EAE發(fā)病前期、急性進(jìn)展期和慢性期的IL-17表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示，在EAE小鼠脊髓組織、大腦組織中，處于EAE發(fā)病前期的A組其IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較處于急性進(jìn)展期和慢性期的B、C組要明顯減少，D組也較E、F組要少（P＜0.05），與上述觀點(diǎn)相符，進(jìn)一步印證了IL-17在EAE病程進(jìn)展中的作用。

目前在臨床上，維生素D已廣泛應(yīng)用于多發(fā)性硬化治療中，獲得了大量臨床研究的證實(shí)。本研究為進(jìn)一步研究維生素D在EAE中的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充小劑量維生素的D、E、F組其神經(jīng)功能評(píng)分以及IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均優(yōu)于缺乏維生素D的A、B、C組（P＜0.05），提示維生素D不僅可以在一定程度上影響IL-17/IL-23軸，抑制IL-17的產(chǎn)生，還可減輕EAE小鼠發(fā)病后神經(jīng)功能損傷。其原因可能是維生素D在體內(nèi)羥化后形成的1,25二羥基維生素D，具有廣泛的抗炎作用，可抑制EAE小鼠中Th17細(xì)胞分化，使體內(nèi)的IL-17表達(dá)水平顯著減少，有助于減輕神經(jīng)系統(tǒng)中白質(zhì)炎性脫髓鞘現(xiàn)象，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，維生素D可通過(guò)抑制IL-17軸調(diào)節(jié)的免疫機(jī)制對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)纖維髓鞘脫失，延緩病情發(fā)展。

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