夏 靜

(江蘇省南京師范大學附屬實驗學校 210000)

1 傳統(tǒng)單克隆抗體制備技術

1.1 抗體 抗體是一類能與抗原特異性結合的免疫球蛋白。其單體結構呈“Y”字型，含有四條多肽鏈。其中，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈，而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈。重鏈和輕鏈靠近N端的氨基酸序列變化很大，稱為可變區(qū)(V)，靠近C端的氨基酸序列相對穩(wěn)定，稱為恒定區(qū)(C)[1]?？贵w的特異性識別和抗原結合能力主要取決于V區(qū)的氨基酸序列。

1.2 抗原決定簇 抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團稱為抗原表位或抗原決定簇。表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)域，而一個抗原大分子往往具有多個不同的抗原表位。在最初依靠免疫小鼠、兔、羊等動物獲得的抗血清，其主要免疫活性成分是多克隆抗體，即由多個漿細胞克隆產(chǎn)生的、針對多種抗原表位的抗體。

1.3 單克隆抗體 制備特異性抗體的理想方法是獲得只針對單一表位的B細胞克隆，并在體外擴增，使其分泌抗體，然而漿細胞在體外培養(yǎng)壽命較短。1975年，Kohler和Milstein建立的體外細胞融合技術，獲得了免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交瘤細胞，克服了以上缺陷。雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，在結構和組成上高度均一(含有完全相同的重鏈和輕鏈)，抗原特異性一致，易于體外大量制備和純化。因此，單克隆抗體具有純度高、特異性強、效價高等特性，已廣泛應用于疾病的診斷、特異性抗原的鑒定、生物靶向藥物的制備等領域[2]。

然而，傳統(tǒng)單克隆抗體技術制備的抗體是小鼠源性抗體，用于人體進行治療時，將作為抗原性蛋白引起人抗小鼠抗體反應，不僅使治療性單克隆抗體半衰期變短，療效減弱，有時還會引起嚴重的不良反應[2]。

2 噬菌體展示技術在人源單克隆抗體領域的運用

隨著重組DNA技術的發(fā)展，包括噬菌體展示技術在內(nèi)的各種抗體人源化基因工程技術的迅速發(fā)展，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段，使全人源單抗(其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用)的產(chǎn)生成為可能。2003年，針對人腫瘤壞死因子(TNF)的第一個全人源抗體阿達木單抗(Adalimumab)上市，可用于治療類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎等疾病。

2.1 何謂噬菌體展示技術 噬菌體展示技術是將目的基因與編碼噬菌體衣殼蛋白基因相連，使多肽或蛋白質與其衣殼蛋白氨基端融合并展示在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對獨立的空間結構和生物活性。在此基礎上建立的噬菌體展示抗體庫，由于在重組載體構建中，不同DNA序列的重鏈基因與不同DNA序列的輕鏈基因隨機組合，可以形成比實體B細胞內(nèi)還要多的組合形式，其篩選范圍較雜交瘤技術擴大了幾千到幾百萬甚至幾億倍。因此，理論上可以從文庫中篩選到針對任何抗原的高親和力人源抗體，并且制備周期相對傳統(tǒng)單抗大為縮短。

2.2 常用的噬菌體類型 噬菌體展示技術常用的噬菌體類型為：單鏈絲狀噬菌體(如M13噬菌體)、λ噬菌體和T4噬菌體，目前在抗體領域應用最多的是M13噬菌體。M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內(nèi)有一個環(huán)狀單鏈DNA分子，長6407個核苷酸，基因組可編碼3類蛋白質，即復制蛋白、形態(tài)發(fā)生蛋白和結構蛋白。

2.3 噬菌體展示技術及其篩選流程 在基因工程抗體的研究中，研究者常將抗體片斷與M13噬菌體尾部的結構蛋白——pⅢ融合表達而展示于噬菌體表面(圖1)，通?？贵w在噬菌體上呈3～5個拷貝展示。由于噬菌體基因組大小的限制，插入外源基因的大小最多1500bp。因此，目前以含有抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的單鏈(single chain fragment variable， scFv)抗體的研究最為常見。scFv抗體的相對分子質量約為25kDa，與完整抗體(分子量約為150kDa)相比，具有體積小、穿透性好等特點，能夠到達深層靶組織，在疾病治療應用方面有獨特的優(yōu)勢。同時由于其分子量小，可以在人體內(nèi)較快被降解代謝，故毒副作用較小。

圖1 M13噬菌體

噬菌體展示技術篩選抗體的流程為：①將106～1011scFv-M13噬菌體克隆與固相化的抗原結合；②洗滌去除低親和力的scFv-M13噬菌體克隆；③洗脫與抗原特異性結合的高親和scFv-M13噬菌體克?。虎芨哂H和噬菌體克隆侵染宿主菌；⑤擴增高親和scFv-M13噬菌體克隆。以上5步驟需循環(huán)3～5次以獲得高親和力的scFv單抗[3]。

2.4 建立噬菌體單鏈抗體文庫 噬菌體單鏈抗體文庫是將通過PCR技術克隆出的全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因，在噬菌體表面進行展示。在構建噬菌體人源scFv抗體文庫時，首先需要從人B淋巴細胞中提取RNA，并以此逆轉錄獲得cDNA，接著用特異性引物分別擴增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，通過重疊延伸PCR技術(SOE-PCR)將兩段基因以一段連接序列相連，獲得scFv基因。將scFv與噬菌體載體經(jīng)過酶切、酶連后，獲得重組噬菌體載體，侵染宿主菌擴增后即獲得噬菌體scFv文庫(圖2)[4]。scFv在體外適宜的條件下，可以自發(fā)折疊成天然構象，保持重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的特異性結合能力。

圖2 噬菌體展示scFv抗體文庫的重組載體構建流程

2.5 scFv抗體的應用 目前已有大量關于scFv抗體應用于人體疾病治療及診斷領域的研究報道。例如，馬帕木單抗(Mapatumumab)是現(xiàn)今臨床篩查和治療DR4分子陽性腫瘤的有力武器，在單獨運用以及與化療藥物聯(lián)用的臨床試驗中都取得了良好療效；在淋巴癌及多種實體瘤的臨床研究中，已證明抗DR-5的Tigatuzumab其毒副作用小，穿透性強，治療組相比對照組有明顯延長患者生存期的效果[5]。治療性單克隆除scFv抗體外，與其具有相似功效的還包括 Conatumumab(AMG 655)、Lexatumumab和Drozitumab等[6]。