范艷艷 鐘磊發(fā) 肖義軍

(福建師范大學生命科學學院 福州 350108)

1980年，Gordon等[1]首次利用原核顯微注射法研究動物轉(zhuǎn)基因技術，此后轉(zhuǎn)基因動物研究得到了快速發(fā)展，其中利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究人類疾病的發(fā)病機制和治療對策已經(jīng)成為了研究熱點。小鼠具有以下的生物學特性：發(fā)育與代謝過程與人類十分相似，其基因組與人的同源率高達95%；易于飼養(yǎng)、繁育，所需維護費用低。所以，相比于其他哺乳動物是較理想的實驗材料。目前轉(zhuǎn)基因小鼠模型在基因功能以及人類疾病機理與治療研究領域得到了廣泛應用[2]。所謂轉(zhuǎn)基因小鼠模型是指能穩(wěn)定表達外源基因、具有特定生物學特征的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可進一步認識基因功能、構(gòu)建特定的疾病模型、制備生物反應器等，對人類基因功能與疾病研究具有重要意義。

1 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備

轉(zhuǎn)基因小鼠模型的開發(fā)與應用，克服了過去只能將外源基因?qū)雴蝹€細胞研究基因功能的弊端，可搭建特定基因與個體之間的橋梁，在活體動物中研究特定基因的生理功能。目前已有多種較成熟的轉(zhuǎn)基因技術可用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型[3]。

原核顯微注射法是目前最常用的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術。它利用顯微操作技術將外源基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，再將受精卵移植到假孕母鼠子宮內(nèi)發(fā)育，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在受精卵中，外源基因與受精卵的基因組發(fā)生隨機整合，然后通過分子生物學方法篩選出整合了外源基因的新生小鼠。在此基礎上，進一步篩選出能穩(wěn)定表達外源基因、具有特定生物學特征的轉(zhuǎn)基因小鼠。原核顯微注射法具有轉(zhuǎn)基因效率高、轉(zhuǎn)入基因容量大(可達100kb)、實驗周期短等優(yōu)點，但也存在技術操作難度較大、基因表達精確度低等問題。此外，由于外源基因是隨機整合于基因組中的，故整合的拷貝數(shù)無法人為控制，還可能因為引起原來基因表達水平的變化而導致小鼠死亡[4]。類似的轉(zhuǎn)基因小鼠制備方法常見的還有精子載體法、脂質(zhì)體介導法、體細胞核移植法等，其存在的問題與顯微注射法類似。

近年來，基因組靶向編輯技術的發(fā)展有效解決了基因表達的精確度問題。最常用的基因組靶向編輯技術是來源于古細菌與細菌免疫系統(tǒng)的成簇規(guī)律間隔短回文重復序列核酸酶系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9， CRISPR/Cas9)，其核心部分為特異性核酸內(nèi)切酶Cas9與向?qū)NA(single guide RNA， sgRNA)。人為設計的整合外源目的基因的特異性sgRNA可通過堿基互補配對原則識別基因組的靶序列，并引導核酸酶Cas9切割靶序列。目標DNA雙鏈的斷裂可激活真核細胞的DNA修復機制，通過非同源末端連接和同源重組，實現(xiàn)對基因組的靶向編輯。該技術基于RNA-DNA的相互作用，目的基因表達精確度高，但sgRNA的設計與構(gòu)建難度較大，時間周期較長、成本較高[5]。常見的可實現(xiàn)基因組靶向編輯的方法還有鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)、基因打靶技術、RNA干擾技術等，在實現(xiàn)較高的基因表達精確度的同時，也存在技術難度大、科研成本高等問題。

2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應用

2.1 探索基因功能 生物學的發(fā)展逐漸闡明了器官、組織、細胞乃至基因的功能與作用機制?；蚴侨祟惿L發(fā)育的總指揮，關鍵基因的突變可導致疾病發(fā)生甚至個體死亡。因此，明確重要基因的功能對基因疾病的預防、早期診斷、治療等至關重要。利用轉(zhuǎn)基因技術可構(gòu)建特定基因敲除或過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，模擬人體的生理環(huán)境，在小鼠體內(nèi)進行基因功能研究，探索基因功能。

2.2 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型 基因突變是引發(fā)疾病的重要因素，利用遺傳學方法在短期內(nèi)獲得特定基因突變并患病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為疾病治療與藥物開發(fā)提供大量臨床前試驗材料。目前廣泛應用的有腫瘤、阿茲海默病及糖尿病等轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

轉(zhuǎn)基因小鼠在腫瘤治療研究中扮演著重要角色，目前已建立多種腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。例如，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)是肝癌的主要誘因之一，HBV長期感染宿主后，病毒基因可整合到宿主基因組中，引起基因突變、基因重組等，從而引發(fā)肝癌。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒中由X基因編碼的HBx蛋白為反式轉(zhuǎn)錄激活因子，可促進相關原癌基因表達，利用原核顯微注射法將X基因及其啟動子與增強子導入小鼠受精卵的雄原核中，經(jīng)過培育、篩選后，獲得HBx轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型，其成癌率為70%～85%，因此該模型在HBV誘發(fā)肝癌機制的研究中運用廣泛。研究揭示了HBx促進肝癌發(fā)生的多種作用機制：如加速肝細胞凋亡、參與DNA修復與合成以及干擾細胞周期等，并進一步明確了藥物的影響與功效[6]。類似的研究有利用小鼠乳腺癌病毒(MMTV)長端重復序列與ras基因和myc基因連接構(gòu)建的乳腺癌小鼠模型，利用癌基因、細胞周期因子構(gòu)建的TCL-1、TCL-1×P53-/-白血病小鼠模型以及利用抗原癌基因SV40T與胰島素基因構(gòu)建的胰島癌小鼠模型等。癌癥小鼠模型的應用可提供腫瘤早、中、晚期的臨床前數(shù)據(jù)，并針對各時期的腫瘤特征采取治療措施，為臨床研究提供參考。

研究表明，10%的阿茲海默病(Alzheimer disease， AD)患者有明確的家族史，目前已確定與AD發(fā)病相關的基因有淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein， APP)基因突變、早老素Ⅰ(PS1)基因突變、早老素Ⅱ(PSII)基因突變和α巨球蛋白基因突變等，并構(gòu)建了50多種AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型。以APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型為例，APP廣泛分布于全身組織，經(jīng)蛋白酶裂解后產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白。為闡明AD的發(fā)病原因是否與APP基因突變相關，通過原核顯微注射法將APP基因整合到小鼠基因組中，篩選獲得穩(wěn)定遺傳APP基因過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，或利用CRISPR/Cas9技術設計相應的sgRNA使APP基因片段被核酸酶Cas9切除，構(gòu)建APP基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，APP基因過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠可在腦部過表達突變體人源APP基因，從而引發(fā)相關病變與認知損傷。重要的是，這些病變均與人類患者的臨床特征相似。

因此，APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型可模擬人類患者的生理特性，通過研究患病小鼠本身的海馬結(jié)構(gòu)、線粒體自噬的變化、AD的發(fā)病機制、藥物對AD治療的作用機制等，可以探索人類AD患者的治療措施[7]。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠模型也用于研究糖尿病等慢性代謝紊亂疾病，糖尿病分為胰島素依賴型(即Ⅰ型糖尿病)和胰島素非依賴型(即Ⅱ型糖尿病)，均存在家族遺傳。利用原核顯微注射法等轉(zhuǎn)基因技術，可構(gòu)建漿細胞抗原Ⅰ基因過表達或敲除的小鼠模型，研究漿細胞抗原Ⅰ與Ⅱ型糖尿病的相互關系。此外，還可以通過異常表達胰島素受體、胰島素下游信號元件等關鍵基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，從基因的角度上更好地了解糖尿病的發(fā)病機制。

2.3 構(gòu)建生物反應器 轉(zhuǎn)基因小鼠除構(gòu)建疾病模型外，還可作為生物反應器使用。利用轉(zhuǎn)基因技術，將特定的人源基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應器，使其生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)、激素、多肽等物質(zhì)。常用的轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應器類型有：乳腺、血液、膀胱生物反應器，可通過小鼠的正常生命活動制備人類所需藥物，既不威脅小鼠的生命安全，又可為生物醫(yī)藥提供巨大的便利，被廣泛應用。相比傳統(tǒng)的細菌、真菌生物反應器，轉(zhuǎn)基因小鼠作為生物反應器，提取物的生物活性較高。目前，已經(jīng)可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應器制備人類的胰島素、抗體、干擾素和生長激素等重要藥物[8]。

3 結(jié)論與展望

轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應用為基因功能和疾病發(fā)病機制的闡明及治療藥物的開發(fā)做出了巨大貢獻。除癌癥、糖尿病及AD外，多種自身免疫系統(tǒng)疾病、代謝疾病、遺傳性疾病、心血管疾病均可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。此外轉(zhuǎn)基因小鼠模型還可用于藥物毒理實驗、器官移植與再生等領域。

總之，轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應用必將逐步向著多元化、多領域、多分支的方向發(fā)展。