范艷艷 鐘磊發(fā) 肖義軍

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

1980年，Gordon等[1]首次利用原核顯微注射法研究動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，此后轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究得到了快速發(fā)展，其中利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制和治療對(duì)策已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。小鼠具有以下的生物學(xué)特性：發(fā)育與代謝過(guò)程與人類十分相似，其基因組與人的同源率高達(dá)95%；易于飼養(yǎng)、繁育，所需維護(hù)費(fèi)用低。所以，相比于其他哺乳動(dòng)物是較理想的實(shí)驗(yàn)材料。目前轉(zhuǎn)基因小鼠模型在基因功能以及人類疾病機(jī)理與治療研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2]。所謂轉(zhuǎn)基因小鼠模型是指能穩(wěn)定表達(dá)外源基因、具有特定生物學(xué)特征的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可進(jìn)一步認(rèn)識(shí)基因功能、構(gòu)建特定的疾病模型、制備生物反應(yīng)器等，對(duì)人類基因功能與疾病研究具有重要意義。

1 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備

轉(zhuǎn)基因小鼠模型的開發(fā)與應(yīng)用，克服了過(guò)去只能將外源基因?qū)雴蝹€(gè)細(xì)胞研究基因功能的弊端，可搭建特定基因與個(gè)體之間的橋梁，在活體動(dòng)物中研究特定基因的生理功能。目前已有多種較成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型[3]。

原核顯微注射法是目前最常用的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)。它利用顯微操作技術(shù)將外源基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，再將受精卵移植到假孕母鼠子宮內(nèi)發(fā)育，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在受精卵中，外源基因與受精卵的基因組發(fā)生隨機(jī)整合，然后通過(guò)分子生物學(xué)方法篩選出整合了外源基因的新生小鼠。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選出能穩(wěn)定表達(dá)外源基因、具有特定生物學(xué)特征的轉(zhuǎn)基因小鼠。原核顯微注射法具有轉(zhuǎn)基因效率高、轉(zhuǎn)入基因容量大(可達(dá)100kb)、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但也存在技術(shù)操作難度較大、基因表達(dá)精確度低等問(wèn)題。此外，由于外源基因是隨機(jī)整合于基因組中的，故整合的拷貝數(shù)無(wú)法人為控制，還可能因?yàn)橐鹪瓉?lái)基因表達(dá)水平的變化而導(dǎo)致小鼠死亡[4]。類似的轉(zhuǎn)基因小鼠制備方法常見的還有精子載體法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、體細(xì)胞核移植法等，其存在的問(wèn)題與顯微注射法類似。

近年來(lái)，基因組靶向編輯技術(shù)的發(fā)展有效解決了基因表達(dá)的精確度問(wèn)題。最常用的基因組靶向編輯技術(shù)是來(lái)源于古細(xì)菌與細(xì)菌免疫系統(tǒng)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列核酸酶系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9， CRISPR/Cas9)，其核心部分為特異性核酸內(nèi)切酶Cas9與向?qū)NA(single guide RNA， sgRNA)。人為設(shè)計(jì)的整合外源目的基因的特異性sgRNA可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別基因組的靶序列，并引導(dǎo)核酸酶Cas9切割靶序列。目標(biāo)DNA雙鏈的斷裂可激活真核細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，通過(guò)非同源末端連接和同源重組，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的靶向編輯。該技術(shù)基于RNA-DNA的相互作用，目的基因表達(dá)精確度高，但sgRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建難度較大，時(shí)間周期較長(zhǎng)、成本較高[5]。常見的可實(shí)現(xiàn)基因組靶向編輯的方法還有鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)、基因打靶技術(shù)、RNA干擾技術(shù)等，在實(shí)現(xiàn)較高的基因表達(dá)精確度的同時(shí)，也存在技術(shù)難度大、科研成本高等問(wèn)題。

2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應(yīng)用

2.1 探索基因功能 生物學(xué)的發(fā)展逐漸闡明了器官、組織、細(xì)胞乃至基因的功能與作用機(jī)制?；蚴侨祟惿L(zhǎng)發(fā)育的總指揮，關(guān)鍵基因的突變可導(dǎo)致疾病發(fā)生甚至個(gè)體死亡。因此，明確重要基因的功能對(duì)基因疾病的預(yù)防、早期診斷、治療等至關(guān)重要。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可構(gòu)建特定基因敲除或過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，模擬人體的生理環(huán)境，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行基因功能研究，探索基因功能。

2.2 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型 基因突變是引發(fā)疾病的重要因素，利用遺傳學(xué)方法在短期內(nèi)獲得特定基因突變并患病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為疾病治療與藥物開發(fā)提供大量臨床前試驗(yàn)材料。目前廣泛應(yīng)用的有腫瘤、阿茲海默病及糖尿病等轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

轉(zhuǎn)基因小鼠在腫瘤治療研究中扮演著重要角色，目前已建立多種腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。例如，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)是肝癌的主要誘因之一，HBV長(zhǎng)期感染宿主后，病毒基因可整合到宿主基因組中，引起基因突變、基因重組等，從而引發(fā)肝癌。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒中由X基因編碼的HBx蛋白為反式轉(zhuǎn)錄激活因子，可促進(jìn)相關(guān)原癌基因表達(dá)，利用原核顯微注射法將X基因及其啟動(dòng)子與增強(qiáng)子導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核中，經(jīng)過(guò)培育、篩選后，獲得HBx轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型，其成癌率為70%～85%，因此該模型在HBV誘發(fā)肝癌機(jī)制的研究中運(yùn)用廣泛。研究揭示了HBx促進(jìn)肝癌發(fā)生的多種作用機(jī)制：如加速肝細(xì)胞凋亡、參與DNA修復(fù)與合成以及干擾細(xì)胞周期等，并進(jìn)一步明確了藥物的影響與功效[6]。類似的研究有利用小鼠乳腺癌病毒(MMTV)長(zhǎng)端重復(fù)序列與ras基因和myc基因連接構(gòu)建的乳腺癌小鼠模型，利用癌基因、細(xì)胞周期因子構(gòu)建的TCL-1、TCL-1×P53-/-白血病小鼠模型以及利用抗原癌基因SV40T與胰島素基因構(gòu)建的胰島癌小鼠模型等。癌癥小鼠模型的應(yīng)用可提供腫瘤早、中、晚期的臨床前數(shù)據(jù)，并針對(duì)各時(shí)期的腫瘤特征采取治療措施，為臨床研究提供參考。

研究表明，10%的阿茲海默病(Alzheimer disease， AD)患者有明確的家族史，目前已確定與AD發(fā)病相關(guān)的基因有淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein， APP)基因突變、早老素Ⅰ(PS1)基因突變、早老素Ⅱ(PSII)基因突變和α巨球蛋白基因突變等，并構(gòu)建了50多種AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型。以APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型為例，APP廣泛分布于全身組織，經(jīng)蛋白酶裂解后產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白。為闡明AD的發(fā)病原因是否與APP基因突變相關(guān)，通過(guò)原核顯微注射法將APP基因整合到小鼠基因組中，篩選獲得穩(wěn)定遺傳APP基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，或利用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgRNA使APP基因片段被核酸酶Cas9切除，構(gòu)建APP基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，APP基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠可在腦部過(guò)表達(dá)突變體人源APP基因，從而引發(fā)相關(guān)病變與認(rèn)知損傷。重要的是，這些病變均與人類患者的臨床特征相似。

因此，APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型可模擬人類患者的生理特性，通過(guò)研究患病小鼠本身的海馬結(jié)構(gòu)、線粒體自噬的變化、AD的發(fā)病機(jī)制、藥物對(duì)AD治療的作用機(jī)制等，可以探索人類AD患者的治療措施[7]。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠模型也用于研究糖尿病等慢性代謝紊亂疾病，糖尿病分為胰島素依賴型(即Ⅰ型糖尿病)和胰島素非依賴型(即Ⅱ型糖尿病)，均存在家族遺傳。利用原核顯微注射法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可構(gòu)建漿細(xì)胞抗原Ⅰ基因過(guò)表達(dá)或敲除的小鼠模型，研究漿細(xì)胞抗原Ⅰ與Ⅱ型糖尿病的相互關(guān)系。此外，還可以通過(guò)異常表達(dá)胰島素受體、胰島素下游信號(hào)元件等關(guān)鍵基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，從基因的角度上更好地了解糖尿病的發(fā)病機(jī)制。

2.3 構(gòu)建生物反應(yīng)器 轉(zhuǎn)基因小鼠除構(gòu)建疾病模型外，還可作為生物反應(yīng)器使用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將特定的人源基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應(yīng)器，使其生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)、激素、多肽等物質(zhì)。常用的轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應(yīng)器類型有：乳腺、血液、膀胱生物反應(yīng)器，可通過(guò)小鼠的正常生命活動(dòng)制備人類所需藥物，既不威脅小鼠的生命安全，又可為生物醫(yī)藥提供巨大的便利，被廣泛應(yīng)用。相比傳統(tǒng)的細(xì)菌、真菌生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)基因小鼠作為生物反應(yīng)器，提取物的生物活性較高。目前，已經(jīng)可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠生物反應(yīng)器制備人類的胰島素、抗體、干擾素和生長(zhǎng)激素等重要藥物[8]。

3 結(jié)論與展望

轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應(yīng)用為基因功能和疾病發(fā)病機(jī)制的闡明及治療藥物的開發(fā)做出了巨大貢獻(xiàn)。除癌癥、糖尿病及AD外，多種自身免疫系統(tǒng)疾病、代謝疾病、遺傳性疾病、心血管疾病均可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。此外轉(zhuǎn)基因小鼠模型還可用于藥物毒理實(shí)驗(yàn)、器官移植與再生等領(lǐng)域。

總之，轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應(yīng)用必將逐步向著多元化、多領(lǐng)域、多分支的方向發(fā)展。