李忠孝 葛啟斌 王俊龍 鄭璐娜 袁菱 程紅濤

癌細胞會對臨床抗癌藥物及類似藥物產(chǎn)生耐藥，同時對結(jié)構(gòu)或作用機制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥[1]。腫瘤細胞的耐藥機制復(fù)雜，其中通過跨膜轉(zhuǎn)運蛋白外排作用來減少耐藥細胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度被視為“經(jīng)典耐藥”[2]。學術(shù)界廣泛認為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白大多屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族，而P-糖蛋白（P-gp）是該家族中的重要一員。抑制P-gp蛋白表達和屏蔽其藥物外排功能，能逆轉(zhuǎn)由P-gp介導的腫瘤耐藥作用[3]。因此，抑制P-gp蛋白表達或干擾其相關(guān)功能，可以逆轉(zhuǎn)相關(guān)腫瘤耐藥，促使耐藥細胞對化療藥物復(fù)敏。漢防己甲素（Tet）又稱為粉防己堿，是從防己科植物粉防己塊根中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，被作為傳統(tǒng)中藥而廣泛用于臨床，具有鎮(zhèn)痛、降血壓、抗風濕、抗纖維化、抗炎性反應(yīng)、抗腫瘤等作用[4]。研究表明，Tet抑制與殺傷腫瘤細胞機制包括誘導細胞凋亡、引起自噬、阻斷Ca2+通道、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性氧分子等[5-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Tet能逆轉(zhuǎn)K562/阿霉素（DOX）和MCF-7/DOX等腫瘤細胞的耐藥[7]。但是，仍未見Tet逆轉(zhuǎn)耐藥型前列腺癌（DU145/DOX）細胞耐藥的可行性報道，其相關(guān)機制研究也很少。因此，本文圍繞Tet聯(lián)合DOX對DU145/DOX細胞的體外抗腫瘤作用、促凋亡誘導、細胞攝取、蛋白及基因水平的機制進行系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人前列腺癌DU145細胞購自中國科學院細胞庫。Tet（批號：20160827，純度＞98%，南京澤朗生物技術(shù)有限公司），配制溶劑為二甲亞砜（DMSO）；DOX鹽酸鹽（貨號：D1515，純度＞99%，美國Sigma公司）；1640細胞培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；青霉素、鏈霉素（美國HyClone公司）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、DMSO和姬姆薩染液（北京索萊寶科技有限公司）；1%Triton X-100裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Pgp-GloTM分析系統(tǒng)（美國Progema公司）；P-gp、β-actin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；Spectra Max M5型多功能酶標儀（美國MD公司）；液相芯片檢測器（美國Luminex公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像儀Image Quant LAS4000（美國GE公司）；IX70型倒置顯微鏡以及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）；QB-9001型微孔板快速振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Avanti J-26 XP高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Guava微量流式儀（美國密理博公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 用DMSO溶解（終濃度為0.5%），再加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液，混合均勻。Tet配制濃度為1～40μM；DOX配制濃度為0.2～8μM。聯(lián)合用藥組DOX+Tet濃度比例設(shè)定為1/1、1/3、1/5。對照組為含有同比例DMSO的不完全培養(yǎng)基。

1.2.2 細胞培養(yǎng) DU145/DOX細胞的制備采用經(jīng)典的DOX濃度梯度誘導法（誘導至DOX對DU145細胞的IC50是耐藥細胞的2倍以上）。將DU145/DOX細胞置于含10%FBS的1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。隔天換液，待細胞覆蓋率達到80%時消化、傳代。

1.2.3 MTT法測定藥物對細胞生長的抑制作用 收集對數(shù)生長期的DU145細胞及DU145/DOX細胞，用0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞數(shù)1×104個/ml，以每孔200μl接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，分別加入含Tet、DOX、不同濃度比例Tet+DOX的培養(yǎng)基，每孔200μl，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h；每孔加入20μl MTT溶液，孵育4h；吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO150μl，振搖10min；用多功能酶標儀檢測490nm處吸光度。計算細胞存活率和半數(shù)抑制濃度（IC50，以DOX濃度計算），細胞存活率=給藥組吸光度/對照組吸光度×100.00%。

1.2.4 流式細胞儀測定藥物誘導細胞凋亡的作用 將1×105個/ml對數(shù)生長期的DU145細胞及DU145/DOX細胞分別接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至70%密度后移除培養(yǎng)基，分別加入含Tet、DOX、不同濃度比例Tet+DOX的培養(yǎng)基，加入相同比例的DMSO的不完全培養(yǎng)基為空白對照組。孵育8h后移除培養(yǎng)基，500μl PBS清洗3次，除去細胞表面藥物及凋亡細胞，100μl胰酶消化，PBS終止消化，制備細胞懸液。取100μl細胞懸液和100μl細胞凋亡檢測試劑Annexin V-PE于96孔板內(nèi)，避光孵育15～30min，用微量流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 胞內(nèi)DOX濃度的測定 取對數(shù)生長期DU145細胞及DU145/DOX細胞，以1×105個/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5ml，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（密度至80%）。分別加入DOX（2μM）、DOX（2μM）+Tet（2～10μM），對照組用含有同比例DMSO的不完全培養(yǎng)基處理。孵育2h后用0.5ml PBS充分清洗3次，胰酶消化后收集細胞懸液。取0.2ml細胞懸液進入流式細胞儀，計算每5 000個細胞的熒光強度。胞內(nèi)DOX濃度由以下公式量化：胞內(nèi)DOX=實驗組DOX平均熒光強度值-對照組平均熒光強度值。

1.2.6 胞內(nèi)熒光探針羅丹明123（R123）定量法 取對數(shù)生長期DU145細胞及DU145/DOX細胞，以1×105個/孔的細胞濃度接種于24孔板，待細胞長至80%密度后，分別給予 DOX（2μM）、Tet（2μM）、DOX（2μM）+Tet（2～10μM）、含有等量DMSO（空白對照組）的完全培養(yǎng)液進行預(yù)處理2h。移除培養(yǎng)液，加入10μM R123工作溶液繼續(xù)孵育2h，0.5ml PBS沖洗細胞3次，加入1%Triton X-100溶液裂解細胞。取0.2ml甲醇沉淀，用熒光分光光度計測定R123的濃度（激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm）；另取等量裂解液用BCA試劑盒測定細胞蛋白濃度。R123在細胞內(nèi)的累積量以R123濃度/蛋白濃度的比值表示（單位：nmol R123/mg蛋白）。

1.2.7 P-gp ATP酶活性評價 采用Pgp-GloTM分析系統(tǒng)檢測P-gp ATP酶活性，按照說明書制備P-gp膜。每孔加入 20μl Buffer、20μl P-gp 膜，每孔分別加入 0.1、0.5、1.0、2.0、6.0、10.0μM Tet或原釩酸鈉（一種廣譜的胞內(nèi)ATP酶抑制劑），37℃孵育5min，加入l0μl Mg ATP，37℃反應(yīng)40min。加入ATP檢測試劑，用液相芯片檢測器測定化學發(fā)光強度，以相對光單位（RLU）表示，ΔRLU=原釩酸鈉RLU-各給藥組RLU。

1.2.8 Western blot法檢測P-gp蛋白表達 取對數(shù)生長期的DU145/DOX細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，至細胞80%貼壁后，給予DOX（2μM）、Tet（10μM）、DOX（2μM）+Tet（10μM）給藥處理，未用藥物處理組和DU145組分別為陰性對照組和細胞對照組。孵育24h后，1ml PBS清洗3次，1%Triton X-100裂解液孵育30min，BCA法測定胞內(nèi)蛋白濃度。取30μg/孔蛋白上樣，進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后，硝酸纖維素膜于5%脫脂牛奶封閉2h，加入一抗（1∶1 000，P-gp；1∶1 000，β-actin），4℃孵育過夜，室溫二抗孵育2h；增強化學發(fā)光法定量測定蛋白表達。1.2.9 RT-PCR法檢測MDR1 mRNA表達 將DU145細胞及DU145/DOX細胞以合適的密度接種于6孔板中，至貼壁后分別進行 DOX（2μM）、維拉帕米（20μM）、Tet（2μM）、DOX（2μM）+Tet（2～10μM）聯(lián)合給藥以及空白對照PBS孵育8h。1ml PBS清洗細胞3次，消化、離心，制備2.5×106/ml的細胞液。利用經(jīng)典一步法提取兩種細胞的RNA[8]。PCR引物[9]：正義鏈引物為 5′-GGGAGCTTAACACCCGACTT-3′，反義鏈引物為 5′-ATTCCCCTGAGAGGACCAAG-3′；參照基因：正義鏈引物為 5′-CTGCAGCATCTTCTCCTTCC-3′，反義鏈引物為 5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。按照試劑盒說明書制備cDNA和PCR體系，94℃變性 15s，55℃退火30～40s，72℃再延伸 1min，擴增 30 個循環(huán)；最后 72℃延伸5min。定量：取15個擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）70V電泳2h，染色后在紫外線下觀察，MDR1 mRNA表達量用MDR1 cDNA/參照cDNA的比值表示[10]。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用雙尾t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合用藥對細胞生長抑制的作用 DOX及Tet+DOX不同濃度比例聯(lián)合用藥組均能明顯抑制DU145細胞增殖。當兩藥濃度比例為1/1時，CI值為0.86，而其他比例聯(lián)合用藥組CI值均＞1。DOX抑制DU145細胞和DU145/DOX細胞增殖的 IC50分別為（0.29±0.03）、（1.62±0.09）μM，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示耐藥細胞構(gòu)建成功。不同濃度比例聯(lián)合用藥組在DU145/DOX細胞實驗中CI值均＜1，隨著Tet比例增加，CI值明顯下降。其中，DOX+Tet（1/5）組IC50按Tet和DOX計算分別為（1.85±0.06）、（0.37±0.02）μM，后者較 DOX 組下降4.38倍。此外，其他比例聯(lián)合用藥組DOX的IC50與DOX組比較，差異亦均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；提示聯(lián)合用藥有助于增強DOX對DU145/DOX細胞的殺傷作用。Tet單藥組對DU145細胞及DU145/DOX細胞的IC50比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同濃度比例聯(lián)合用藥組對DU145細胞及DU145/DOX細胞的抑制效應(yīng)及CI（n=6）

2.2 聯(lián)合用藥對細胞凋亡誘導的作用 DOX及Tet+DOX不同濃度比例聯(lián)合用藥組均能明顯誘導DU145細胞凋亡。DOX組與聯(lián)合用藥組比較，未出現(xiàn)凋亡誘導增強效應(yīng)；與DU145/DOX細胞的DOX組比較，凋亡率是它的1.86倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在DU145/DOX細胞實驗中，不同濃度比例聯(lián)合用藥組凋亡率均明顯高于DOX組（P＜0.01）。從趨勢上看，隨著Tet比例增加，聯(lián)合用藥組對DU145/DOX細胞凋亡誘導能力明顯增強。其中DOX+Tet（1/5）組凋亡率是DOX組的2.1倍，提示聯(lián)合用藥能促進DU145/DOX細胞凋亡，有Tet濃度依賴性。Tet單藥組對DU145細胞及DU145/DOX細胞的凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2；提示這種效應(yīng)可能與Tet干擾了DU145/DOX細胞的耐藥環(huán)境有關(guān)。

2.3 Tet干預(yù)對細胞攝取DOX的影響 無論是單藥組或聯(lián)合用藥組，每5 000個DU145細胞內(nèi)DOX的熒光強度值均在60左右，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但相同用藥組在DU145/DOX細胞系上出現(xiàn)明顯差異：DOX組被DU145/DOX細胞攝取的熒光強度值為18.59±2.41，隨著Tet的加入，聯(lián)合用藥組的熒光強度值明顯增強，且呈明顯的Tet濃度依賴性。DOX+Tet（1/5）組被DU145/COX細胞攝取的熒光強度值為50.24±4.24，明顯高于其他用藥組（均P＜0.01），見圖1；提示Tet的參與有助于促進DOX在DU145/DOX細胞內(nèi)的聚集，可能是聯(lián)合用藥增加細胞毒性的主要原因。

表2 不同濃度比例聯(lián)合用藥組對DU145細胞及DU145/DOX細胞凋亡誘導的作用（n=4）

圖1 Tet干預(yù)對DU145細胞及DU145/DOX細胞攝取DOX的影響（n=4，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 Tet預(yù)處理對R123細胞內(nèi)累積的影響 Tet、DOX、聯(lián)合用藥預(yù)處理后，R123在DU145細胞的累積量均未見明顯改變?？瞻最A(yù)處理后，R123在DU145細胞及DU145/DOX細胞的累積量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明耐藥環(huán)境干擾了R123細胞內(nèi)聚集行為。經(jīng)空白對照處理與DOX處理后，R123在DU145/DOX細胞內(nèi)的累積量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組比較，單獨Tet預(yù)處理組、不同濃度比例聯(lián)合用藥組的R123細胞內(nèi)累積量均明顯增多（均P＜0.01），且增強效應(yīng)與Tet比例呈正相關(guān)，見圖2。提示DU145/DOX細胞的耐藥可能被Tet逆轉(zhuǎn)，這種逆轉(zhuǎn)效應(yīng)與DOX無關(guān)。

圖2 Tet預(yù)孵育2h對R123在DU145細胞及DU145/DOX細胞的累積量的影響（n=4，*P＜0.01）

2.5 不同濃度Tet對P-gp ATP酶活性的影響 廣譜的胞內(nèi)ATP酶抑制劑原釩酸鈉將胞內(nèi)各種磷酸酶“凍結(jié)”，若測試組能抑制P-gp ATP酶活性，則體現(xiàn)在ΔRLU值為正值，反之為負值。Tet（2～10μM）干預(yù)組ΔRLU均高于空白對照組（P＜0.01），表明Tet（2～10μM）對P-gp ATP酶活性具有明顯刺激作用，且在0.5～10μM的濃度范圍內(nèi)，對P-gpATP酶活性作用具有明顯的劑量依賴性（P＜0.01）。與維拉帕米組（陽性對照）比較，Tet對ATP酶的活性刺激作用稍弱，見圖3。

圖3 不同濃度Tet對DU145/DOX細胞P-gp ATP酶活性的影響（n=3；與空白對照組比較，*P＜0.01；與 Tet 10μM 組比較，△P＜0.01）

2.6 Tet對P-gp蛋白表達的影響 根據(jù)凝膠電泳和灰度值歸一化法，筆者對Tet能否改變DU145/DOX細胞膜上P-gp蛋白表達進行半定量測定。Tet（10μM）、DOX（2μM）+Tet（10μM）對DU145/DMR細胞中P-gp蛋白表達量明顯低于雙陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），這表明Tet能通過降低P-gp蛋白表達來實現(xiàn)DOX細胞攝取增強效應(yīng)，且這種效應(yīng)不受DOX的影響。DOX（2μM）對DU145/DMR細胞中P-gp蛋白表達量，與雙陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

2.7Tet對DU145/DOX細胞MDR1 mRNA表達的影響與對照組比較，Tet處理組、不同濃度比例聯(lián)合用藥組均對DU145/DOX細胞MDR1 mRNA表達產(chǎn)生影響，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。維拉帕米組、DOX組對DU145/DOX細胞MDR1 mRNA表達的影響不大，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖5。

圖4 Tet對DU145/DOX細胞中P-gp蛋白表達的影響（a：凝膠電泳圖；b：定量圖；n=3；與雙陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 Tet對DU145/DOX細胞MDR1 mRNA表達的影響（n=3；與對照組比較，*P＜0.01）

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)Tet具有抑制腫瘤細胞生長、減輕放化療毒性反應(yīng)、放療增敏和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等作用[11-12]。本研究表明，與DOX單藥比較，Tet+DOX不同濃度比例聯(lián)合用藥對DU145/DOX細胞生長抑制作用明顯增強，聯(lián)合用藥具有很好的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，且這種效應(yīng)與Tet比例呈正相關(guān)；此外，不同濃度比例聯(lián)合用藥在促DU145/DOX細胞凋亡方面也表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。上述Tet介導的耐藥細胞毒性和細胞凋亡增強效應(yīng)在DU145細胞系上并不明顯，表明Tet可能通過干擾耐藥環(huán)境來協(xié)助DOX提高抗腫瘤活性。為證實筆者的假想，通過Tet與DOX同時給藥測定胞內(nèi)DOX含量的方法，以及Tet預(yù)處理DU145/DOX細胞后測定胞內(nèi)P-gp底物熒光探針R123累積量的方法，證實了Tet無論是提前給藥還是與DOX同時給藥，都能增強P-gp蛋白底物的細胞攝取量；同時，這種現(xiàn)象在DU145細胞系上并不明顯。本文選取耐藥和非耐藥型2種細胞系，設(shè)置空白對照組、單藥組和不同濃度比例聯(lián)合用藥組，最后推斷出Tet可能是通過干擾DU145/DOX細胞的P-gp正常生理功能，提高了DOX細胞內(nèi)化能力，進而促使DU145/DOX細胞對DOX的復(fù)敏，最終達到DOX抗腫瘤活性增強的效應(yīng)。

P-gp屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族，由MDR1基因編碼，是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的核心因素。P-gp在前列腺癌、卵巢癌中高表達，可引起化療藥物抗癌療效降低，最終導致治療失敗[13-14]。有報道證實，P-gp被抑制后可增強化療藥物在耐藥患者中的療效[14]。Zhu等[15]研究發(fā)現(xiàn)Tet發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥機制與P-gp直接相關(guān)?；诩毎拘宰饔谩⒓毎蛲龊图毎麛z取實驗結(jié)果，筆者假設(shè)Tet的干預(yù)可能通是過干擾DU145/DOX細胞的P-gp正常生理功能來協(xié)同DOX抑制細胞生長，促進細胞凋亡，提高細胞攝取能力。因此，筆者設(shè)計了單藥組和不同濃度比例聯(lián)合用藥組，并觀察Tet對P-gp ATP酶活性、P-gp蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實驗設(shè)計的濃度范圍內(nèi)，各濃度比例Tet均能有效降低DU145/DOX細胞P-gp蛋白表達，且這種效應(yīng)與DOX是否存在無關(guān)，這為聯(lián)合用藥的合理性提供了先決條件。值得重視的是，Tet直接干擾P-gp表達的效應(yīng)，而經(jīng)典的P-gp抑制劑維拉帕米卻不具備，這是Tet相較于傳統(tǒng)耐藥逆轉(zhuǎn)劑的一大優(yōu)勢；此外，各濃度比例的Tet均能有效刺激P-gp ATP酶活性，降低P-gp ATP的能量供應(yīng)，導致P-gp功能受損。筆者還從基因水平考察了Tet的潛在耐藥逆轉(zhuǎn)機制。通過經(jīng)典的RT-PCR技術(shù)比較了不同濃度比例Tet、維拉帕米對DU145/DOX細胞MDR1 mRNA表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tet在抑制耐藥基因方面優(yōu)勢明顯，而維拉帕米尚不能在基因水平逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象，這是Tet相較于傳統(tǒng)耐藥逆轉(zhuǎn)劑的另一大優(yōu)勢。

綜上所述，本研究證實Tet聯(lián)合DOX能逆轉(zhuǎn)DU145/DOX細胞耐藥，并從蛋白和基因水平剖析了具體作用機制。筆者認為Tet來源易得、價格低廉、不良反應(yīng)小，干預(yù)耐藥的通路廣泛，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的耐藥逆轉(zhuǎn)劑與化療藥物聯(lián)合使用，以應(yīng)對臨床化療導致的耐藥問題。筆者下一步將構(gòu)建腫瘤體內(nèi)動物模型，評價體內(nèi)結(jié)果與體外數(shù)據(jù)是否具有相關(guān)性，為臨床轉(zhuǎn)化作深入、系統(tǒng)的研究。