秦靚 傅超 俞艷艷 丁菁 武文靜 姚江穎 何俊 張建鋒 張亮亮

結(jié)直腸癌是消化道常見的高度惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。盡管惡性腫瘤手術(shù)、放化療等治療取得了較大進展，但針對結(jié)直腸癌手術(shù)預后（生存及遠處轉(zhuǎn)移）的結(jié)果欠佳[1]。因此，尋找適宜的結(jié)直腸癌患者手術(shù)預后指標或標志物，以盡早發(fā)現(xiàn)預后不良的高危患者是目前研究熱點及難點[2]。研究表明，浸潤性細胞免疫反應的改變與機體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系密切[3]。相關(guān)文獻報道許多外周循環(huán)血細胞指標（如淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞等）可預測惡性腫瘤患者的預后，但對結(jié)直腸癌的預測報道很少[4]。本研究以CD4+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞為研究基礎(chǔ)，建立循環(huán)淋巴細胞免疫指數(shù)（circulating T-cell immune index，CTII）模型，探討其與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系以及評估手術(shù)預后的價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010年1月至2013年1月行手術(shù)切除且經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌的138例患者（杭州市第三人民醫(yī)院124例，成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院14例）為研究對象，其中男 83例，女 55例；年齡 30～72（44.37±12.7）歲。入選標準：（1）所有患者接受相應的標準化結(jié)直腸癌治療策略；（2）采集血標本前均未接受過其他任何抗腫瘤、輸血、放化療等治療。排除標準：（1）合并感染性疾病導致淋巴細胞異常者；（2）患有血液系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的疾病；（3）合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CTII模型的建立 收集所有患者術(shù)前的循環(huán)CD4+調(diào)節(jié)性 T細胞、CD8+調(diào)節(jié)性 T細胞、CD28+細胞毒性T細胞的檢查資料，并計算CTII，CTII=CD28+細胞毒性T細胞/（CD4+調(diào)節(jié)性T細胞×CD8+調(diào)節(jié)性T細胞）。患者的年齡、性別、腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)等資料均依據(jù)病程記錄和檢查報告進行歸納。

1.2.2 隨訪計劃的制定 通過患者復診、電話、信件等方式進行隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個月隨訪1次，2年后每6個月隨訪1次。術(shù)后隨訪5年，截止至2018年1月，失訪10例（包括非腫瘤相關(guān)死亡患者）。研究的主要終點事件為無病生存期（RFS）和總生存期（OS）。RFS：手術(shù)之日至第1次出現(xiàn)局部或區(qū)域復發(fā)轉(zhuǎn)移、隨訪終止或死亡的時間。OS：手術(shù)之日至出現(xiàn)任何原因引起的死亡或隨訪終止的時間。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。根據(jù)ROC曲線計算CTII預測結(jié)直腸癌患者5年生存期的最佳截點值；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier曲線、log-rank檢驗進行生存分析，并運用Cox比例風險回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CTII臨界值的確定及分組 CTII模型預測本研究結(jié)直腸癌患者5年RFS和OS的AUC分別為0.702和0.679，見圖1。根據(jù)AUC面積的比較以及相應約登指數(shù)的計算，確定以RFS為研究基礎(chǔ)，獲得CTII最佳截點值為0.08。根據(jù)最佳截點值將結(jié)直腸癌患者分為高CTII組（≥0.08）76例和低CTII組（＜0.08）62例。

圖1 CTII模型預測結(jié)直腸癌患者5年RFS和OS的ROC曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

2.2 CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系 不同CTII組患者的TNM分期、分化程度以及循環(huán)CD4+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 CTII與結(jié)直腸癌患者的預后生存分析 高CTII組患者RFS、OS均明顯低于低CTII組（均P＜0.01），見圖2。

2.4 影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風險回歸模型分析 單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度、CTII指數(shù)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后RFS和OS密切相關(guān)（均P＜0.05）；而腫瘤直徑、循環(huán)CD28+細胞毒性T細胞僅與RFS有關(guān)（均P＜0.05），CD8+調(diào)節(jié)性T細胞僅與OS有關(guān)（P＜0.05）。將上述P＜0.05的因素納入多因素分析，結(jié)果顯示TNM分期、分化程度、CTII是影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后RFS和OS的獨立危險因素（均P＜0.05），見表2。

圖2 CTII與結(jié)直腸癌患者預后的生存曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

3 討論

近年來研究證實，炎癥免疫細胞浸潤會改變腫瘤微環(huán)境，參與或抑制惡性腫瘤細胞的增殖和遷移[5]。相關(guān)研究表明，免疫細胞指數(shù)模型可作用于腫瘤免疫機制，從而發(fā)揮作用[6]。因此，免疫細胞指數(shù)模型可能成為惡性腫瘤的新生物標志以及判斷預后的細胞靶點。CTII模型是以CD4+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞為研究基礎(chǔ)，通過拮抗-促進的相互作用來調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展，從而實現(xiàn)復雜的免疫防御功能，在臨床上具有準確的預測價值和廣闊的應用前景。

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其致死率較高[1]。因此，亟需尋找一種新的腫瘤標志物來判斷預后，以提高結(jié)直腸癌的個體化治療效果。Hagland等[7]報道在循環(huán)淋巴細胞于Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者分布中，CD4+及CD8+T細胞參與惡性腫瘤侵襲，進而影響預后。進一步研究表明，CTII與多種惡性腫瘤遠期預后密切相關(guān)，如肺癌、肝癌、胰腺癌[8-10]。目前關(guān)于CTII對結(jié)直腸癌的預測價值尚不清楚。因此，本研究從結(jié)直腸癌患者外周血細胞入手，利用ROC曲線評價結(jié)直腸癌患者預后，發(fā)現(xiàn)CTII模型在RFS所對應的AUC大于OS所對應的AUC，但差異無統(tǒng)計學意義；在一定程度上提示RFS的最佳截點在評價結(jié)直腸癌患者預后的準確性方面具有優(yōu)勢。進一步分析CTII與臨床特征及預后生存的關(guān)系，結(jié)果表明CTII與TNM分期、分化程度有關(guān)，推測CTII變化可能打破腫瘤微環(huán)境免疫平衡，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。亦有研究表明TNM分期、分化程度是影響結(jié)直腸癌治療及預后的指標[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CTII與結(jié)直腸癌患者術(shù)后的RFS和OS密切相關(guān)，高CTII提示預后較差。同時進一步作Cox比例風險回歸模型分析，證實TNM分期、分化程度、CTII是影響結(jié)直腸癌患者預后不良的獨立危險因素?？梢?，CTII可作為評價結(jié)直腸癌術(shù)后復發(fā)風險和OS的預測指標。

表2 影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風險回歸模型分析

目前關(guān)于上述規(guī)律的發(fā)生機制尚未證實，主要認為惡性腫瘤的發(fā)生起點在于感染或炎癥反應，此類感染或炎癥可引起CTII升高。本實驗結(jié)果為CD28+細胞毒性T細胞增多，或CD4+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細胞減少。CD28+細胞毒性T細胞是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要炎性細胞，與腫瘤-免疫平衡的發(fā)生、發(fā)展存在相互效應。一方面，腫瘤細胞可釋放粒細胞集落刺激因子、IL-2、TNF等細胞因子，從而促進CD28+細胞毒性T細胞大量增殖[12]；另一方面，CD28+細胞毒性 T細胞通過 PD-1、GSK-3等途徑與腫瘤細胞對抗[13]。這意味著CD28+細胞毒性T細胞可間接反映腫瘤惡性程度。此外，有研究表明，CD4+/CD8+淋巴細胞介導的細胞毒性反應以及釋放的細胞因子，均能抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移行為[14]。隨著腫瘤的生長，機體炎癥與抗腫瘤之間失去平衡，體內(nèi)循環(huán)淋巴細胞比例發(fā)生變化。因此，外周血CTII高則反映患者全身炎性反應較嚴重，抗腫瘤免疫功能較差，提示預后不良。

綜上所述，CTII模型對結(jié)直腸癌患者預后的評估具有指導價值，是一項易檢測、重復性好、價格低廉的腫瘤相關(guān)性炎癥指標；其中高CTII提示預后不良。聯(lián)合中性粒細胞/淋巴細胞、血小板/淋巴細胞等因素建立模型，對結(jié)直腸癌遠處轉(zhuǎn)移的診斷具有參考價值[15-16]；建議進一步聯(lián)合多指標進行研究，以提高預測的準確性。