鄭曉葉，許俊榆，鄭天倫，朱凝瑜，曹飛飛

（1. 浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310023；2. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州 310012）

南美白對蝦（Penaeus vannamei）因生長迅速、抗病力強(qiáng)成為全球主要的對蝦養(yǎng)殖品種之一[1]。近年來，我國在南美白對蝦海水養(yǎng)殖成功后，又進(jìn)行了苗種淡化培育，并在越來越多淡水地區(qū)養(yǎng)殖成功，由此帶來了較大的經(jīng)濟(jì)效益[2]。但隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及不同來源苗種的引進(jìn)，對蝦疾病問題日益復(fù)雜，病害頻發(fā)給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。及時、準(zhǔn)確地診斷疾病，盡快采取有效應(yīng)對措施是保證對蝦健康和生態(tài)養(yǎng)殖的關(guān)鍵[3]；加強(qiáng)檢測，篩選出健康優(yōu)良的蝦苗，則是養(yǎng)殖成功的重要手段。

白斑綜合征（White spot disease，WSD），桃拉綜合征（Taurasyndrome，TS），傳染性皮下及造血器官壞死病（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN）被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）劃為必須通報的甲殼類動物疫病，其中WSD（病原為White spot syndrome virus，WSSV）被我國列入一類動物疫病名錄，TS（病原為Tauras syndrome yirus，TSV）和IHHN（病原為Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）被我國列入二類動物疫病名錄[4]。蝦肝腸包蟲（Enterocytozoom hepatopenaei，EHP）自2013年在我國沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)被發(fā)現(xiàn)后，檢出率有增高趨勢，具有較高的流行風(fēng)險，是導(dǎo)致南美白對蝦生長緩慢的主要病原之一[5]。對蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）是近年來在南美白對蝦發(fā)病樣品中檢測到的一種新病原，易造成蝦空腸空胃、體色變淡、肝胰腺組織松散，可使部分感染蝦出現(xiàn)軟殼和體表發(fā)

紅[6-7]，因其能夠感染克氏原螯蝦、澳洲淡水龍蝦等，且具有傳染性，成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)的新威脅。本研究通過采樣檢測IHHNV、WSSV、EHP、TSV和SHIV 5種病原，了解浙江省南美白對蝦主養(yǎng)區(qū)苗種的病原攜帶情況，從而為浙江省蝦病防控、健康養(yǎng)殖提供參考，為制定合理的保健預(yù)防對策提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測用蝦苗 2017年3—7月，采集杭州、紹興、寧波、嘉興 4個市62家淡化苗種場及養(yǎng)殖場，共129批次的蝦苗樣品。同一時間、同一苗種場采集單一來源苗種≥150尾作為1份樣品，稱之為1批次。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒（天根DP304-03），Qiagen Rneasy MiNi Kit（50） 試 劑盒（QIAGEN，德國 74014），Prime Script?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試 劑 盒（TAKARA 6210A），2×GoldStar MasterMix（Dye）（康為世紀(jì) CW0682L）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 樣品采集按照《水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范》（SC/T 7103-2008）進(jìn)行。將采集的活蝦苗樣品，浸泡固定于3倍體積的95%酒精中，然后置于低溫冰盒中，及時送實(shí)驗(yàn)室檢測。樣品大小為0.5～1 cm，用50 mL離心管浸泡保存。如不能立即檢測，就將樣品暫存于?80 ℃ 冰箱中。提取核酸前用液氮研磨組織，將均質(zhì)后的組織分別用于DNA和RNA提取。

1.2.2 DNA提取 取30 mg 蝦苗組織勻漿置于1.5 mL離心管中，參照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，將提取的DNA保存于?20 ℃冰箱。

1.2.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 取30 mg蝦苗組織勻漿置于1.5 mL無RNA酶的離心管中，參照Rneasy MiNi Kit（50）試劑盒說明書提取RNA，并將提取的RNA迅速進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。將反應(yīng)混合液 65 ℃ 保溫 5 min 后，置于冰上迅速冷卻；將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液緩慢混合均勻后，置于 PCR 儀上 42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min，4 ℃ 終止。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于?20 ℃冰箱。

表1 5種南美白對蝦病原引物

1.2.4 PCR檢測 以提取的DNA或反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別進(jìn)行IHHNV[8]、WSSV[9]、TSV[10]、EHP[11]和 SHIV[7]的特異性 PCR 檢測，并設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。PCR反應(yīng)體系為 50 μL：2×Gold Star Master Mix（Dye）25 μL、Forward Primer（10 μmol/L）2 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL、Template DNA ＜0.5 μg，加ddH2O至總體積50 μL。檢測5種病原的引物和參考方法見表1。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用1×TAE配置的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照（圖1）；比對陽性對照條帶位置，判斷是否為陽性。若為陽性，則將PCR產(chǎn)物送測序，與NCBI上的序列進(jìn)行比對，確定是否真的攜帶病原。

圖1 蝦苗樣品PCR檢測結(jié)果電泳圖

2 結(jié)果

2.1 總體檢測情況

2017年從浙江省4個市共采樣129批次南美白對蝦蝦苗樣品，經(jīng)檢測分析發(fā)現(xiàn)：攜帶SHIV的48批，攜帶EHP的41批次，批陽性檢出率較高，分別為37.21%和31.78%；攜帶IHHNV的27批次，批陽性檢出率為20.93%；攜帶WSSV的2批次，批陽性檢出率為1.55%；未檢出TSV。

2.2 不同采樣地區(qū)檢測情況

分別從杭州市、紹興市、嘉興市和寧波市采集50、20、16和43批次蝦苗樣品。除TSV未檢出外，其余4種病原均有檢出（圖2）：WSSV僅在寧波市苗種場樣品中檢出，批陽性檢出率為4.65%；IHHNV在寧波市的批陽性檢出率最高，為48.84%；EHP和SHIV在各地均有檢測出，其中寧波市的EHP和SHIV批陽性檢出率均最高，分別為37.21%和55.81%。

圖2 不同采樣地區(qū)批病原陽性檢出率

2.3 不同苗種類型檢測情況

可追溯到苗種類型的蝦苗共103批次，其中一代苗76批次、二代苗12批次、普通苗15批次。不同類型苗種病原攜帶情況如圖3所示：一代苗樣品中，檢出3種病原，EHP的批陽性檢出率最高，為35.53%；二代苗樣品中，除TSV未檢出外，其他4種病原均有檢出，SHIV的批陽性檢出率最高，為66.67%；普通苗中，檢出3種病原，且批陽性檢出率普遍較高，其中IHHNV最高，為86.67%。

圖3 不同類型南美白對蝦苗種批病原陽性檢出率

2.4 不同來源蝦苗檢測情況

采集的蝦苗樣品主要來自廣東、海南和福建等地，分別為46、44和21批次。不同來源蝦苗的陽性檢出情況如圖4所示：WSSV在來自廣東省和海南省的蝦苗中有檢出，但批陽性檢出率較低；IHHNV在來自福建省和廣東省的蝦苗中檢出率較高，分別為38.10%和 32.61%；EHP和SHIV檢出率普遍較高，其中廣東省蝦苗中EHP和SHIV陽性檢出率最高，分別為43.48%和41.30%。

圖4 不同來源苗種的批病原陽性檢出率

3 討論

隨著集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，南美白對蝦面臨的病毒病威脅越來越嚴(yán)重。多數(shù)病毒病具有傳播速度快、發(fā)病率高、致死率高等特點(diǎn)，給蝦養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[12]。本研究檢測了南美白對蝦苗種中IHHNV、WSSV、EHP、TSV和SHIV 5種病原的攜帶情況，在所有129批次蝦苗樣品中未檢出TSV，這與王筱珊[12]、Yu等[13]、林開等[14]、施慧等[15]的調(diào)查結(jié)果基本一致。他們從2009年開始在全國很多地區(qū)進(jìn)行檢測，都未檢測到TSV?！吨袊鷦游镄l(wèi)生狀況報告》[16-17]顯示，2015年的TSV檢出率為0.3%（1/379），2016年未有陽性樣品檢出，表明TSV在很多地區(qū)已得到了很好地控制，也提示病毒病可以通過有效防控，使感染率維持在一個較低水平。

調(diào)查結(jié)果顯示，129批次樣品蝦苗中，WSSV的批陽性檢出率為1.15%，且只在寧波市被檢出，說明浙江省通過加大對該病的防控力度，取得了較好效果。自2012年WSSV感染高峰期過后[18]，WSSV對對蝦的危害程度有所減弱，但由于傳播迅速、致死率高，其依然是危害南美白對蝦健康的重要病原。IHHNV是導(dǎo)致對蝦生長緩慢的主要病原之一，并且能夠垂直傳播。IHHNV 1981年首次在美國夏威夷地區(qū)的細(xì)角濱對蝦中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時造成的死亡率高達(dá)90%以上[19]。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，IHHNV的批陽性檢出率為20.93%，且隨采樣地區(qū)的不同，變化也很大，如寧波市的IHHNV陽性檢出率高達(dá)48.84%，而嘉興市的未檢出。此外，隨苗種類型和來源的不同，IHHNV感染率波動也很大，普通苗陽性檢出率最高達(dá) 86.67%，來自福建省、廣東省的苗種陽性檢出率也超過了30%。查閱往年IHHNV傳播情況可知，該檢測結(jié)果與2010—2012年的IHHNV感染率[20]相近。2015年江蘇省IHHNV感染率達(dá)到了39.48%[12]；2016年的國家水生動物疫病監(jiān)測情況顯示，全國8?。ㄖ陛犑校z出IHHNV陽性樣品，平均樣品陽性檢出率為22.2%，而2015年有6?。ㄖ陛犑校z出IHHNV陽性樣品，平均陽性檢出率為21.6%[16-17]。由此可知，IHHNV的傳播性較強(qiáng)，需加大對IHHNV的預(yù)防力度。

南美白對蝦感染EHP后生長緩慢或停滯[21-22]，從而影響南美白對蝦的產(chǎn)量。此次調(diào)查中的EHP陽性檢出率高達(dá) 31.78%，且不同種類、來源、采樣地區(qū)的陽性率變化不大。自 2009 年開始，EHP在東南亞地區(qū)多數(shù)國家的養(yǎng)殖對蝦中被發(fā)現(xiàn)[23]，雖然其不會造成對蝦的大量死亡，但會導(dǎo)致感染對蝦生長緩慢或生長停滯，如果大規(guī)模擴(kuò)散，必定造成對蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[24-25]，因此仍需得到重視。自2013年以來，我國沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)先后發(fā)現(xiàn)EHP流行，且檢出率較高。2015年遼寧省檢出率高達(dá)34.6%[26]，粵西地區(qū)檢出率為41.38%[24]；黃海水產(chǎn)研究所OIE參考實(shí)驗(yàn)室在我國沿海多省份進(jìn)行的對蝦流行病調(diào)查顯示，2015年EHP陽性率為35.6%，2016年為30.9%，EHP陽性樣品主要是南美白對蝦[16-17]，與本次調(diào)查結(jié)果基本一致。

蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）是2014年在我國浙江省一批嚴(yán)重發(fā)病死亡的對蝦樣品中分離鑒定出的新虹彩病毒，可感染南美白對蝦、羅氏沼蝦，導(dǎo)致的死亡率高，是對蝦養(yǎng)殖業(yè)的新威脅[6]。此次調(diào)查采用靈敏度較高的套式PCR檢測[7]，在129批次樣品中發(fā)現(xiàn)SHIV陽性檢出率高達(dá) 37.21%，且在不同采樣地區(qū)、苗種類型和來源下，SHIV檢出率均較高，尤其在寧波市，SHIV批陽性檢出率高達(dá)55.81%，因而需要盡快制定防控措施，加以防范。

4 結(jié)論

對浙江省4個地區(qū)129批次對蝦苗種樣品的檢測結(jié)果表明，SHIV、EHP、IHHNV的批陽性檢出率較高，是浙江省對蝦苗種攜帶的主要病原，需要重點(diǎn)加以防范。從苗種類型看，一代苗攜帶的病原種類最少，且攜帶率較低。從苗種來源看，來自福建省、廣東省、海南省的蝦苗均有病原檢出，其中來自福建省蝦苗的IHHNV攜帶率最高，來自廣東省蝦苗的EHP和SHIV攜帶率最高。由于浙江省的南美白對蝦苗種主要依靠外地輸入，因此必須加強(qiáng)引入苗種的檢疫工作，尤其是來自福建省和廣東省的蝦苗。