許 杰，霍文慧，鄧 威，劉 群，孫 悅，楊 凱，薛淑霞，李 娜

（天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221）

自2013年以來，我國廣東、浙江、江蘇、海南、山東、天津、遼寧等沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)先后發(fā)現(xiàn)有蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）流行。EHP可導(dǎo)致對蝦生長極其緩慢或停滯，養(yǎng)殖成功率低，經(jīng)濟(jì)損失巨大。EHP于2009年在泰國養(yǎng)殖的生長緩慢斑節(jié)對蝦（Penaeusmonodon）中被首次分離而命名[1]，是一種傳染性強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，近年來在泰國、印度、越南、馬來西亞、印度尼西亞和中國等主要對蝦養(yǎng)殖國家中流行，可感染凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦等重要養(yǎng)殖蝦類，是對全球?qū)ξr養(yǎng)殖生產(chǎn)影響較嚴(yán)重的疾病之一[2]。

EHP隸屬于微孢子蟲目（Microsporidia）微孢子蟲科（Nosematidae）腸胞蟲屬（Enterocytozoon），成熟孢子呈橢圓形，大小為0.7 μm×1.1 μm，有1個(gè)細(xì)胞核、5～6圈的極絲、1個(gè)后液泡、1個(gè)附著在極絲上的固著盤，胞壁由原生質(zhì)膜、低電子密度孢子內(nèi)壁（10 nm）和高電子密度孢子外壁（2 nm）組成，是一種個(gè)體較小的微孢子蟲。EHP從早期孢子的孢原質(zhì)到成熟孢子，均在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中生長發(fā)育[1]，主要分布在對蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞[3]和腸上皮細(xì)胞[4]。

對蝦感染EHP后臨床癥狀不明顯，攝食正常，不會出現(xiàn)大批死亡。在肝胰腺組織病理切片中可觀察到從早期的孢原質(zhì)到成熟孢子不同生長階段的EHP[2]；肝胰腺組織病變嚴(yán)重，肝胰腺腔體變小或消失，部分肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死或脫落[5]。感染EHP病蝦的血淋巴中反映肝胰腺功能的生物化學(xué)參數(shù)值均比健康蝦高很多[6]。對蝦消瘦，重量降低，大小不均，重量離散，可對養(yǎng)殖產(chǎn)量造成直接影響[7]。Kathy等[8]研究發(fā)現(xiàn)，印度尼西亞患白便綜合征（White feces syndrome，WFS）的凡納濱對蝦甲殼松弛，腸壁發(fā)炎，后腸呈白色，在對蝦白色糞便中檢測出密集的EHP孢子和相對數(shù)量較少的桿狀細(xì)菌。據(jù)泰國學(xué)者報(bào)道，養(yǎng)殖凡納濱對蝦感染EHP時(shí)，雖表現(xiàn)為WFS，但WFS與EHP之間沒有直接的因果關(guān)系[9]。Biju等[2]在印度發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦EHP發(fā)病率高，并伴有細(xì)菌感染。另有試驗(yàn)表明，EHP是導(dǎo)致凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素[10]。

針對近年EHP在我國沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)的流行蔓延，2015—2017年連續(xù)3年對天津市養(yǎng)殖對蝦EHP流行情況進(jìn)行調(diào)查，分析病原在種苗生產(chǎn)與對蝦養(yǎng)殖中的流行特點(diǎn)及趨勢，為養(yǎng)殖對蝦病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣

2015—2017年根據(jù)不同養(yǎng)殖季節(jié)，從天津市漢沽區(qū)、大港區(qū)、塘沽區(qū)、寧河區(qū)、靜海區(qū)、津南區(qū)和西青區(qū)等對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，采集凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、羅氏沼蝦、澳洲小龍蝦、南非金剛蝦，以及部分餌料生物（貝肉、鹵蟲、魷魚、沙蠶、商品化冷凍豐年蟲、商品化冷凍橈足類）等樣品。具體采樣方法依據(jù)《水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范》（SC/T7103-2008）的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測

采用全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站推薦的病原EHP套式PCR檢測方法，進(jìn)行樣品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物電泳、結(jié)果判定。檢測EHP所用引物見表1。陽性樣品PCR產(chǎn)物送金唯智生物科技（北京）有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI Genbank中進(jìn)行BLAST比對、驗(yàn)證。

表1 檢測EHP所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 總體檢測情況

2015—2017年，從天津市養(yǎng)殖對蝦主產(chǎn)區(qū)共采集對蝦及有關(guān)樣品324批次，進(jìn)行EHP PCR檢測和測序驗(yàn)證。結(jié)果顯示，EHP陽性率在2017年出現(xiàn)大幅下降，3年的陽性率分別為56.96%、69.52%、29.28%（表2）。

表2 2015—2017年天津市養(yǎng)殖對蝦EHP檢測結(jié)果

2.2 各分類樣品檢測情況

2015—2017年在天津市養(yǎng)殖凡納濱對蝦中均檢測出EHP陽性，2016年陽性率高達(dá)70.19%，2017年降為29.32%；而斑節(jié)對蝦、羅氏沼蝦、澳洲小龍蝦、南非金剛蝦中，均未檢出EHP。養(yǎng)殖凡納濱對蝦的仔蝦、幼蝦、中成蝦中均檢出EHP，其中仔蝦階段最低，幼蝦階段最高。對蝦餌料生物中，檢測發(fā)現(xiàn)魷魚、沙蠶和商品化冷凍橈足類等攜帶有EHP，而貝肉、鹵蟲和商品化冷凍豐年蟲中未檢出EHP。2015—2017年的具體檢測結(jié)果見表3。

3 討論

本研究于2015—2017年從天津市對蝦主產(chǎn)區(qū)采集324批次樣品進(jìn)行EHP檢測，發(fā)現(xiàn)2015—2016年的陽性率較高，而2017年顯著下降。這是因?yàn)閺?016年開始，天津市按照農(nóng)業(yè)部要求，加強(qiáng)了EHP病原監(jiān)測，及時(shí)發(fā)布疫情預(yù)警，并采取了相應(yīng)的預(yù)防控制措施。

表3 2015—2017年天津市養(yǎng)殖對蝦有關(guān)樣品的EHP檢測結(jié)果

針對國內(nèi)沿海地區(qū)凡納濱對蝦生長緩慢的現(xiàn)象，我國開展了EHP調(diào)查研究。黃倢[11]認(rèn)為仔蝦或幼蝦階段生長緩慢主要是因?yàn)楦腥玖藗魅拘云は潞驮煅M織壞死病毒（Infectious hypodermal &haematopoietic necrosis virus，IHHNV），而養(yǎng)成期生長停滯則可能是感染了EHP。王雅博等[12]2015年8月在遼寧省26個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)EHP和IHHNV兩種病原混合感染比例較高，僅在小蝦樣本中檢測到EHP，感染率達(dá)100%，而在大蝦樣品中未檢出。陳祿芝等[13]檢測了87份粵西地區(qū)的凡納濱對蝦樣品，發(fā)現(xiàn)成蝦和種蝦樣品的EHP檢出率較高，分別為93.75%和66.67%，蝦苗檢出率較低，為24.24%。本研究發(fā)現(xiàn)，幼蝦、中成蝦養(yǎng)殖階段EHP陽性率偏高，仔蝦階段EHP檢出率偏低，與上述研究觀點(diǎn)相近。

幼蝦、中成蝦養(yǎng)殖階段EHP陽性率比仔蝦蝦苗養(yǎng)殖階段高的原因可能是：（1）對蝦感染EHP與養(yǎng)殖環(huán)境緊密相關(guān)，高溫季節(jié)的患病概率高于低溫季節(jié)。夏季正值對蝦養(yǎng)殖中成期，由于多高溫陰雨天氣，養(yǎng)殖水體低溶氧、高水溫、高氨氮等因素，導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦病害抵抗力減弱，應(yīng)激加重，從而導(dǎo)致發(fā)病率增加。（2）我國在養(yǎng)殖日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中檢出了 EHP[14]。隨著對蝦親蝦及苗種的大量引進(jìn)，其攜帶的病原對我國現(xiàn)有對蝦品種及其餌料環(huán)境生物造成潛在威脅，養(yǎng)殖對蝦極易通過野生生物、鮮活或冷凍餌料感染EHP，導(dǎo)致幼蝦、中成蝦養(yǎng)殖階段EHP感染率上升。（3）近年來，由于采用集約化高密度養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖對蝦出現(xiàn)多種病害并發(fā)趨勢，對蝦感染疾病后，免疫力下降，導(dǎo)致感染率上升。有研究顯示，感染白斑綜合征病毒（White sport syndrome virus，WSSV）后的中國對蝦仔蝦對微孢子蟲的敏感性增加，對蝦微孢子蟲感染率達(dá)90%以上[15]。

由于EHP孢子壁較厚，可達(dá)到10 nm左右，一般藥物難進(jìn)入蟲體內(nèi)，使得傳統(tǒng)殺蟲藥物對EHP較難奏效，而具有確切治療作用的治療藥物尚未見報(bào)道，所以針對EHP感染，只能以預(yù)防為主。EHP可垂直傳播，即通過親蝦受精卵或種苗垂直傳播給子代，也可水平傳播給其他個(gè)體。因此，培育無特定病原（SPF）蝦苗或抗特定病毒病原（SPR）蝦苗或種蝦，重視親蝦的疫病檢疫，引進(jìn)不帶EHP的健康親蝦進(jìn)行繁育，以及跟蹤監(jiān)測、隔離標(biāo)苗棚等一系列控制措施，可有效降低對蝦EHP感染率。對蝦可經(jīng)口攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染EHP[9]。陳祿芝[13]在未經(jīng)處理的海水樣品中檢測到EHP，而在經(jīng)砂濾、臭氧消毒、精密過濾、紫外消毒等一系列處理過的水體中未檢測出EHP，因此消毒處理水體可以預(yù)防EHP傳播。葉健等[16]檢測商品化鹵蟲卵、商品化鹵蟲幼體、冰凍成體鹵蟲，發(fā)現(xiàn)冰凍成體鹵蟲攜帶EHP，陽性率為50%，并且鹵蟲的EHP攜帶量在一個(gè)相對較高水平。本研究也發(fā)現(xiàn)魷魚、沙蠶和商品化冷凍橈足類等對蝦餌料生物攜帶有EHP，檢出率為50%，這增加了通過投喂生物餌料直接或間接導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦感染EHP的風(fēng)險(xiǎn)。

總之，采用PCR、LAMP及定量PCR等分子生物學(xué)方法，對病原體進(jìn)行嚴(yán)格檢驗(yàn)檢疫[17]，加強(qiáng)凡納濱對蝦幼體期和養(yǎng)殖過程中EHP的實(shí)時(shí)監(jiān)測，及時(shí)采取預(yù)防控制措施，可以防止養(yǎng)殖過程中EHP的侵入，減少經(jīng)濟(jì)損失。

4 小結(jié)

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)：2015—2017年天津市養(yǎng)殖對蝦中存在不同程度的EHP流行，3年的陽性率分別為56.96%、69.52%、29.28%，呈顯著下降趨勢，這與天津市嚴(yán)格控制親蝦品質(zhì)及引進(jìn)健康種苗，以及加強(qiáng)EHP檢疫監(jiān)測有關(guān)；凡納濱對蝦幼蝦、中成蝦的EHP陽性率高于仔蝦，這與養(yǎng)殖環(huán)境、餌料污染和養(yǎng)殖密度大有關(guān)。