陳裕華，甘兆年，何日文，蔡一凡，張海明，李 印，沈 丹

（1. 廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510440；2. 廣州市農(nóng)業(yè)局，廣東廣州 510440；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

施用化學農(nóng)藥是當前農(nóng)作物病蟲害防治的主要手段[1]。近年來，隨著施用化學農(nóng)藥數(shù)量和范圍的日益擴大，在消滅有害昆蟲的同時，對于蜜蜂等授粉昆蟲的危害也日趨嚴重[2-3]。蜜蜂農(nóng)藥中毒又稱化學中毒，是養(yǎng)蜂生產(chǎn)中存在的一個嚴重問題。蜜蜂中毒后大多情況下會出現(xiàn)死亡。其中，外勤蜂大多死于田間，采集蜂帶回毒物于箱內(nèi)后，可毒死蜂箱內(nèi)的蜜蜂幼蟲及青年工蜂。中毒的蜂群群勢大多快速下降，甚至出現(xiàn)全群死亡[4]。

2018年3月13日，廣東省廣州市花都區(qū)畜牧獸醫(yī)部門接到某荔枝果場內(nèi)蜂農(nóng)報告，稱自2018年2月7日起陸續(xù)出現(xiàn)中華蜜蜂批量死亡情況。該荔枝果場內(nèi)共有中華蜜蜂680群，截至2018年3月13日，已有430群的采集蜂、內(nèi)勤蜂或新出房幼蜂出現(xiàn)批量死亡，蜂群襲擊率為63.24%。檢疫人員按照《蜜蜂檢疫規(guī)程》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2010〕41號）相關(guān)要求，在現(xiàn)場展開了問詢調(diào)查和現(xiàn)場查看，并委托廣東省生物資源應用研究所蜜蜂與蜂產(chǎn)品研發(fā)中心實驗室對《蜜蜂檢疫規(guī)程》中的5種常見蜜蜂疫病進行病原學鏡檢和PCR擴增檢測。另外，委托廣州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所，對該荔枝果場內(nèi)的死亡蜜蜂、蜂蜜和花粉，以及周圍菜場的蔬菜樣本進行農(nóng)藥殘留檢測，查找引起中華蜜蜂批量死亡的原因。

1 方法

1.1 病例定義

1.1.1 疑似病例 2018年1月1日至4月5日，廣州市花都區(qū)出現(xiàn)死亡數(shù)量異常增多的蜂群（蜂群中個體死亡數(shù)量超過30%）。

1.1.2 確診病例 經(jīng)實驗室檢測確定為農(nóng)藥含量超標的疑似病例。

1.2 現(xiàn)場調(diào)查

通過問詢蜂農(nóng)，了解該荔枝果場內(nèi)近期有無使用農(nóng)藥史，以及該果場周圍的農(nóng)作物種植情況；同時對該果場內(nèi)所有蜂群的來源及用藥史進行問詢，并檢查蜂群臨床表現(xiàn)。

1.3 蜜蜂疫病的病原學鏡檢

對美洲幼蟲腐臭病，參照Graaf等[5]報道的方法；對歐洲幼蟲腐臭病，參照Forsgren等[6]報道的方法；對蜜蜂孢子蟲病，參照Fries等[7]報道的方法；對蜜蜂白堊病，參照Aronstein等[8]報道的方法。在顯微鏡下進行檢查。

蜜蜂蜂螨?。簩γ鄯溆紫x，從2個以上子脾中隨機抽取50只蜂蛹，在解剖鏡下（或其它方式）逐個檢查蜂蛹體表有無蜂螨寄生；對成年工蜂，隨機抽取5群蜜蜂，從每個蜂群中隨機抽取50只成年工蜂，置于50 mL離心管內(nèi)，再加入40 mL 75%酒精（圖1-A），渦旋振蕩30 s后，逐一挑出所有成年工蜂，檢查成年工蜂的蜂螨寄生情況（圖1-B）。

圖1 實驗室檢測蜜蜂成年工蜂的大小蜂螨寄生情況

1.4 蜜蜂疫病的PCR擴增檢測

PCR引物設計參照Graaf等[5]和Forsgren等[6]的報道，引物均由大連寶生物工程有限公司合成。利用E.Z.N.A.? Insect DNA Kit，提取幼蟲或成年工蜂的組織DNA，以美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病病原的特異性引物進行PCR擴增。PCR擴增體系均為：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL，再補足滅菌ddH2O至總體積25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃變性3 min，35個循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR反應結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。每次擴增反應均設置陰性對照，且試驗重復3次以上。

1.5 蜂群及周圍蔬菜樣本的農(nóng)藥殘留檢測

委托廣州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所，檢測該荔枝果場內(nèi)6處放蜂點的新死亡蜜蜂、死亡較久蜜蜂、蜂蜜和花粉各1份，周邊村民種植的結(jié)球甘藍2份。檢測項目為甲胺磷、氯菊酯、氯氰菊酯、啶蟲脒、噠螨靈、苯醚甲環(huán)唑、嘧霉胺、滅蠅胺、甲霜靈、霜霉威、多效唑、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、醚菊酯、蟲酰肼、吡唑醚菌酯等72種農(nóng)藥殘留。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用Excel 2010軟件，對調(diào)查數(shù)據(jù)進行分析，并對此事件進行損失估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 放蜂場地的空間分布

經(jīng) 了 解， 該 荔 枝 果 場 位 于 N23°29′5″，E113°21′59″，海拔50 m，周圍多為住宅小區(qū)和魚塘。果場內(nèi)共有6處放蜂點，分別飼養(yǎng)86、71、131、104、128和160群中華蜜蜂，分屬于6戶蜂農(nóng)個體戶。蜂場周邊3 km范圍內(nèi)有1個蔬菜種植基地，距蜂場約1.6 km（圖2）。

圖2 放蜂場地位置及空間分布

2.2 蜂群受害情況

由于蜂農(nóng)沒有詳細記錄每日蜂群受害情況，因此無法繪制詳細的流行曲線，只能根據(jù)6個蜂農(nóng)的回憶，以7 d（1周）為時間段，繪制了蜂群受害流行曲線（圖3）。

圖3 蜂群受害流行曲線

經(jīng)統(tǒng)計，該荔枝果場內(nèi)共有中華蜜蜂680群，其中430群出現(xiàn)采集蜂、內(nèi)勤蜂或新出房幼蜂批量死亡情況，蜂群襲擊率為63.24%。

2.3 菜場、荔枝果場及蜂農(nóng)用藥情況

經(jīng)了解，距該荔枝果場約1.6 km處的菜場以生產(chǎn)葉菜類蔬菜為主，主要品種有菜心、小白菜、花椰菜、油麥菜和結(jié)球甘藍等。從2018年1月起，該菜場陸續(xù)有零星使用農(nóng)藥的情況，而近3個月內(nèi)，該荔枝果場及蜂農(nóng)均未有使用農(nóng)藥或蜂藥的情況。

2.4 蜂群臨床檢查情況

2.4.1 箱外觀察 多數(shù)巢門口均有死蜂。死亡較久的蜜蜂中，有的舌已吐出，有的蜷著身體，但未發(fā)現(xiàn)有爬蜂或翅殘缺不全的幼蜂。

2.4.2 箱內(nèi)觀察 隨機抽取5群蜜蜂，依次打開蜂箱蓋、副蓋，發(fā)現(xiàn)巢脾、巢框、箱壁和箱底的蜜蜂無異常行為；提取子脾，發(fā)現(xiàn)子脾上卵蟲排列整齊、色澤正常。

2.5 蜜蜂疫病的病原學鏡檢

2.5.1 美洲和歐洲幼蟲腐臭病 本次抽檢的5個蜜蜂幼蟲樣本中，均未發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陽性的游離狀桿菌芽孢（圖4-A），以及0.5 μm×1.0 μm，革蘭氏陽性的單個、短鏈或呈簇狀排列的披針形球菌（圖4-B），表明抽檢樣本中無美洲和歐洲幼蟲腐臭病病原。

2.5.2 蜜蜂孢子蟲病 本次抽檢的5個蜜蜂成年工蜂腸道樣本中，均未發(fā)現(xiàn)有卵圓近米粒形、邊緣灰暗的蜜蜂微孢子蟲，說明鏡檢樣本中無蜜蜂孢子蟲病病原。

2.5.3 蜜蜂白堊病 此次抽查的5箱蜂群中，均未發(fā)現(xiàn)有白堊病狀蟲尸，顯微鏡下亦未發(fā)現(xiàn)白色棉絮菌絲和充滿孢子球的子囊，說明樣本中無蜜蜂白堊病病原。

2.5.4 蜜蜂蜂螨病 現(xiàn)場及實驗室檢查發(fā)現(xiàn)，本次抽檢的50個蜂蛹和所有成年工蜂中，均未有大小蜂螨寄生情況。

2.6 蜜蜂疫病病原的PCR擴增檢測

PCR擴增反應后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，本次抽檢的5個蜜蜂幼蟲DNA樣本中，美洲幼蟲腐臭?。▓D5-A）和歐洲幼蟲腐臭病（圖5-B）的PCR擴增檢測結(jié)果皆為陰性，表明抽檢樣本中無美洲和歐洲幼蟲腐臭病病原。

2.7 蜂群及周圍蔬菜樣本的農(nóng)藥殘留檢測

圖5 美洲和歐洲幼蟲腐臭病的PCR擴增檢測結(jié)果

廣州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所的檢測報告顯示，新死亡蜜蜂和死亡較久蜜蜂樣本中均可檢出吡唑醚菌酯和噠螨靈這兩種農(nóng)藥，而蜂蜜、蜂花粉和結(jié)球甘藍樣本中均無農(nóng)藥殘留檢出。其中，新死亡和死亡較久蜜蜂樣本中的吡唑醚菌酯檢測值分別為0.007 8 mg/kg和0.019 mg/kg，而新死亡和死亡較久蜜蜂樣本中的噠螨靈檢測值分別為0.004 5 mg/kg和0.009 9 mg/kg。

3 損失估算

按受害的430群中華蜜蜂中，每群損失1脾，100元/脾（流蜜期的市價）計算，此次事件造成直接經(jīng)濟損失約為43 000元；按1個荔枝流蜜期，每脾中華蜜蜂能產(chǎn)蜜2～3 kg，80元/kg（荔枝蜜的零售價）估算，此次蜜蜂批量死亡造成間接經(jīng)濟損失為68 800～103 200元。

4 討論

依據(jù)《蜜蜂檢疫規(guī)程》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2010〕41號），經(jīng)過現(xiàn)場調(diào)查、蜜蜂疫病的病原學鏡檢和蜜蜂疫病的PCR擴增檢測，證明此次蜜蜂批量死亡并非《蜜蜂檢疫規(guī)程》中的五種常見蜜蜂檢疫性病害導致的。

蔬菜基地2018年1月初開始不間斷使用農(nóng)藥，2月初油菜花盛開，而2月7日蜜蜂大量死亡，蜂群出現(xiàn)大面積受害，這說明蜜蜂批量死亡與農(nóng)藥使用在時間上存在很強的關(guān)聯(lián)性。且蜂農(nóng)種植的荔枝樹3月18日開花后，蜂群不需要遠距離飛行至蔬菜基地采蜜，蜜蜂死亡數(shù)量和蜂群受害程度急劇下降，也說明蜜蜂批量死亡與蔬菜基地使用農(nóng)藥有關(guān)。

吡唑醚菌酯和噠螨靈是當前在蔬菜和水果生產(chǎn)中均可以使用的農(nóng)藥[9-10]。其中，吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）是兼具吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，目前已用于100多種作物，僅次于嘧菌酯，是全球第二大殺菌劑[11]。當前研究表明，吡唑醚菌酯施藥1、3、7和15 d后，對蜜蜂的死亡率與清水對照組間無顯著差異，說明吡唑醚菌酯對蜜蜂是安全的，不會引發(fā)蜜蜂的農(nóng)藥中毒[12]。

噠螨靈（Pyridaben）是一種新型高效、廣譜、低毒的殺螨殺蟲劑，主要通過抑制肌肉組織、神經(jīng)組織和電子傳遞系統(tǒng)染色體I中谷氨酸脫氫酶的合成，從而抑制害螨的呼吸代謝[13]。其殺螨特性為：對害螨具有很強的觸殺作用，速效性好，害螨在接觸藥液1 h內(nèi)即被麻痹擊倒，停止爬行或危害；持效期較長，在幼螨及第一若螨期使用，一般藥效期可達1個月，甚至達50 d[14]。據(jù)何杏等[15]報道，20%的噠螨靈可濕性粉劑對中華蜜蜂的半致死濃度（LC50）為3.072 mg/L，對蜜蜂來說為高毒。本次中華蜜蜂批量死亡事件中的新死亡蜜蜂和死亡較久蜜蜂樣本中均含有一定濃度的噠螨靈殘留，再結(jié)合死亡較久蜜蜂“有的舌已吐出，有的卷著身體”這一臨床表現(xiàn)，推斷引起蜜蜂批量死亡的可能原因為噠螨靈等農(nóng)藥引起的蜜蜂中毒。

避免蜜蜂農(nóng)藥中毒的關(guān)鍵是做好預防[4，16]。主要預防措施有：①周邊農(nóng)戶施用農(nóng)藥的時機應與蜜蜂采蜜時間錯開，在花期施用農(nóng)藥，施藥農(nóng)戶應提前1周左右通知周邊5 km內(nèi)的養(yǎng)蜂者。②根據(jù)施藥情況，對蜂群采取保護措施。用布將蜂箱蓋上，暫時關(guān)閉巢門，但要給蜜蜂通風和喂水。對施用殘留期長或毒性大的施藥區(qū)，應盡快把蜂場撤離到5 km以外的安全區(qū)。③施用農(nóng)藥盡量采取統(tǒng)一行動，杜絕零星用藥，在植物開花期施藥應選擇蜜蜂出巢前或晚間施藥最安全。④嚴禁蜂農(nóng)使用噴過農(nóng)藥的噴霧器噴蜂，不用裝過農(nóng)藥的車廂裝運蜂群，禁止在有農(nóng)藥污染水源附近放蜂。

5 結(jié)論

該事件經(jīng)現(xiàn)場調(diào)查和實驗室檢測，最終確定為噠螨靈等農(nóng)藥引起的蜜蜂中毒，通過分析和排查可能的病因，最終認定是由距蜂場約1.6 km的蔬菜種植基地使用農(nóng)藥導致的。因此，要做好蜜蜂農(nóng)藥中毒的預防工作，采取相應措施，防止農(nóng)藥中毒事件發(fā)生，避免出現(xiàn)較大經(jīng)濟損失。