劉 東，宋姍姍，于 靜，劉紅祥，高天佐，李 彬，王群義，劉豐波，劉 平，欒棟祖，杜元釗

（青島易邦生物工程有限公司動物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266032）

禽流感（Avain Influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽類全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病。AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，其關(guān)鍵致病性基因?yàn)镠A基因。在宿主胰蛋白酶的作用下，HA基因能裂解為HA1和HA2，因而產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子[1]。

根據(jù)對禽類致病性的不同，AI又分為高致病性（High pathogenic AI，HPAI）和低致病性（Low pathogenic AI，LPAI）或溫和性（Mildly pathogenic AI，MPAI）[2]。MPAI 雖然對禽類的致病性較弱，但其基因來源復(fù)雜、分布廣，又易繼發(fā)其他致病微生物感染，對養(yǎng)禽業(yè)具有潛在危害，尤其是 H9 亞型。目前監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，有些毒株的基因組已發(fā)生了多元重組，基因片段來源也多樣化[3]。因此，有必要實(shí)時監(jiān)測當(dāng)前H9N2亞型AIV流行毒株HA基因的遺傳變異情況。本研究對2013年到2018年4月河北、河南、江蘇、安徽、山東、湖南、吉林和四川等省份養(yǎng)殖場采集的雞群喉、泄殖腔拭子以及疑似病料進(jìn)行了 H9 亞型 AIV病原學(xué)檢測，對其HA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序與分析，繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行了分子遺傳進(jìn)化分析，為H9亞型AI防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集2013—2018年我國河北、河南、江蘇、安徽、山東、湖南、吉林和四川等15個省份養(yǎng)殖場疑似流感暴發(fā)雞群的喉、泄殖腔拭子以及病料樣品。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒：購自天恩澤生物公司；HiScript?II One Step RT-PCR Kit：購自諾唯贊生物公司；DNA Marker DL2000：購于寶生物工程（大連）有限公司。

超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾-DL-CJ-1NDII），低溫冷凍離心機(jī)（湖南湘儀TGL-6），

PCR 擴(kuò)增儀（美國Bio-rad T100），微波爐（格蘭仕）和紫外光凝膠成像系統(tǒng)（培清-JS-680C）。

1.3 引物

按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒 RT-PCR 試驗(yàn)方法》（NYT772-2004）中的H9 亞型AIV RT-PCR檢測方法，選用 H9-732U/H9-732L 特異性引物，擴(kuò)增H9 亞型血凝素基因片段。引物序列如下：H9-732U 5'-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3'；H9-732L 5'-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3'。引物由北京華大基因科技有限公司合成。

根據(jù) GenBank 上已經(jīng)發(fā)表的AIV毒株參考序列，設(shè)計擴(kuò)增 HA 全長基因片段引物。設(shè)計的引物序列為：上游5'-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3'；下游 5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'。引物由北京華大基因科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取

參照天恩澤RNA提取試劑盒說明書，具體如下：取組織研磨液 200 μL，加 1 000 μL 溶液A，混勻；加 200 μL 氯仿溶液，震蕩混勻，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；小心吸取水相 600 μL 加入到新的DEPC 處理過的 1.5 mL 離心管中；加等體積的溶液B混勻，分兩次加到離心吸附柱中，12 000 r/min，離心30 s；棄穿透液，加700 μL 洗液，12 000 r/min，離心30 s；棄穿透液，12 000 r/min，空離30 s；將離心柱轉(zhuǎn)移至新的 DEPC 處理過的 1.5 mL 離心管中，加60 μL洗脫液，12 000 r/min，離心30 s，得到RNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HA基因RT-PCR

采用HiScript?II One Step RT-PCR Kit試劑盒，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 45 s，33 次循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.6 基因序列測定

將PCR產(chǎn)物送往北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.7 H9亞型毒株分子進(jìn)化分析

利 用 NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov） 中 的Influenza virus resource 數(shù)據(jù)庫，搜索H9 亞型 AIV HA 基因序列，并同測序結(jié)果進(jìn)行Alignment在線對比，然后利用 MEGA 7.0 軟件，繪制進(jìn)化樹，選取代表毒株進(jìn)行HA 基因分子演化分析，了解近年來我國H9 亞型AIV毒株HA 基因的演化特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 HA區(qū)域核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性分析

通過PCR產(chǎn)物純化測序和序列拼接，得到80個毒株的HA基因開放閱讀框，其中2013年11株，2014年 15株，2015年 8株，2016年 18株，2017年17株，2018年11株。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，80株H9亞型AIV HA基因核苷酸同源性為85.4%～99.6%，氨基酸同源性為 85.9%～99.9%。

2.2 HA基因遺傳進(jìn)化分析

從 GenBank 中選取 5 個 H9 亞型代表毒株及11個我國普遍使用疫苗毒株的 HA 基因序列（表1），與分離的80株毒株HA 基因進(jìn)行對比和遺傳進(jìn)化樹分析（圖1）。從圖中可看出2013—2018年分離到的H9亞型 AIV大部分在H9.4.2.5分支上，只有2013年云南的A-CK-yunnan-2013在H9.4.2.6分支上。H9.4.2.5分支又有許多小分支，其中：79個分離株在Y4亞群，與Y4疫苗株的核苷酸同源性在93.7%以內(nèi)；60個分離株在WJ57亞群，與WJ57疫苗株核苷酸同源性在95.5%以內(nèi)。遺傳進(jìn)化樹分析顯示：2013—2018年的分離毒株在遺傳進(jìn)化樹上基本按時間順序排列，而且隨著時間推移，新分離毒株逐漸遠(yuǎn)離疫苗毒株。

表1 選用的H9亞型AIV參考株

2.3 HA基因關(guān)鍵氨基酸變異分析

圖1 2013—2018年我國大陸部分地區(qū) H9 亞型 AIV 的 HA基因多樣性分析

參照人源H3N2流感病毒A/Achi/2/1968毒株的HA基因氨基酸序列[8]，推導(dǎo)并比較80個毒株HA基因關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸序列。結(jié)果顯示：80株病毒HA基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列（321～329）中，除1株為PSRSSN、1株為PSRSNR外，其余78株均為PSRSSR，均符合低致病性禽流感特征。這些毒株的裂解位點(diǎn)氨基酸序列雖為低致病性特征，但不同于參考毒株Y280（PARSSR），其第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸（A）突變?yōu)闃O性氨基酸（S）。通過核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這80株毒株HA裂解位點(diǎn)序列的第5位氨基酸殘基均為S，由AGT編碼。

H9亞 型 AIV HA 基 因 在 109、161、163、191、198、202、203和146～150及232～237位（H9序列位置）構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的袋狀結(jié)構(gòu)。80株病毒基因受體結(jié)合位點(diǎn)右側(cè)壁（146～150）比較保守，主要模式為GTSKA，受體結(jié)合位點(diǎn)左側(cè)壁（232～237）中的234和235位正在發(fā)生突變，主要模式為NGLMGR，而國內(nèi)參考毒株Y280的模式為NGLQGR，BJ94、F98的模式為NGQQGR。受體結(jié)合位點(diǎn)的改變主要是在198位，呈現(xiàn)T/V/A/K的突變，226位氨基酸位點(diǎn)與唾液酸受體α-2,6Gal和α-2,3Gal的結(jié)合特性有關(guān)。本研究中的所有H9N2亞型AIV的226位氨基酸均為亮氨酸（L），而早期的大多為谷氨酰胺（Q）。這說明2013年以后的H9N2病毒具備了結(jié)合α-2,6Gal唾液酸受體的能力，病毒感染哺乳動物，甚至是人的概率大大增加（表2）。

表2 H9亞型AIV裂解位點(diǎn)和袋狀結(jié)合區(qū)的突變

4個毒株（4/80）含有8個潛在的糖基化位點(diǎn)，而且這4個毒株只有在2013年和2014年分離得到（表3），9個毒株含有6個糖基化位點(diǎn)，也是2013年和2014年的分離株。與Y280相比，其他毒株在第203位氨基酸大多發(fā)生了T→I/V，導(dǎo)致了第200位糖基化位點(diǎn)逐漸缺失，第297位氨基酸發(fā)生了P→S的變化，使得295位多出了一個潛在的糖基化位點(diǎn)NCS。新的糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)或者原有糖基化位點(diǎn)的缺失均有可能通過改變受體結(jié)合位點(diǎn)和HA蛋白的抗原性來感染新宿主。

表3 H9亞型AIV HA蛋白糖基化位點(diǎn)

3 討論

H9N2 亞型 AIV 在世界范圍內(nèi)廣泛分布，在遺傳進(jìn)化上，可以分為北美系和歐亞系兩大分支，而歐亞系又進(jìn)一步衍生出以 BJ/94-like 或 Y280-like、G1-like、Y439-like 以及 F/98-like 等為代表的病毒亞群[4]。根據(jù)新的亞系命名系統(tǒng)，我國 H9N2 亞型AIV分離毒株主要來源于H9.4.2 分支，而4.2分支又演化為4.2.1～4.2.6分支。本次分離到的 80 株H9N2 亞型AIV毒株均屬于H9.4.2.5 分支的獨(dú)立（Y4）亞群。

本研究分析了2013—2018年分離得到的80株H9亞型AIV的HA基因序列，發(fā)現(xiàn)這80株HA基因的裂解位點(diǎn)序列大多為PSRSSR，與參考毒株Y280不同，其第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸（A）突變?yōu)闃O性氨基酸（S）。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這80株病毒在HA裂解位點(diǎn)序列的第5位氨基酸殘基均為S，由AGT編碼，如果發(fā)生A替換T/C，該位點(diǎn)的S就會變?yōu)镽，那么這些毒株就會變?yōu)楦咧滦圆《局辏蚨哂袧撛诙玖υ鰪?qiáng)的風(fēng)險。

毒株的潛在糖基化位點(diǎn)也是影響毒株毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)之一。在本研究分離的80株毒株中，2013—2014年有4株含有8個潛在糖基化位點(diǎn)，與F98、Y280等參考毒株相比多出了295NCS這一潛在糖基化位點(diǎn)，有9株含有6個潛在糖基化位點(diǎn)，與F98、Y280等參考毒株相比消失的潛在糖基化位點(diǎn)是200NRT，而其余分離株，特別是2015年以后的毒株，在第203位氨基酸大多發(fā)生了T→I/V的變化，導(dǎo)致了第200位糖基化位點(diǎn)逐漸缺失，第297位氨基酸發(fā)生了P→S的變化，使得295位多出了一個潛在的糖基化位點(diǎn)NCS。新的糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)或者原有糖基化位點(diǎn)的缺失均有可能通過改變受體結(jié)合位點(diǎn)和HA蛋白的抗原性來感染新宿主。

目前滅活疫苗免疫仍是防控 H9N2 亞型禽流感的主要方法。該方法雖然起到了一定的防控作用，但由于疫苗的長期使用，導(dǎo)致免疫壓力持續(xù)存在，使得H9N2亞型AIV可能會不斷重組和變異[5]。因此，疫苗株的選擇一定要與現(xiàn)場流行毒株匹配，否則就起不到理想的保護(hù)作用。為及時了解和掌握H9N2亞型AIV的流行動態(tài)及變異情況，必須做好病毒的長期跟蹤監(jiān)測工作，這樣可以根據(jù)病毒的流行和變異情況，及時研發(fā)有效的針對性疫苗，確保H9亞型AI的防控效果。