李小妹 付春云 龍喜貴 王立芳 蒙達(dá)華 曾尚娟 莫梅珍 王張紅羅仕玉 李奇霏 黃麗利 聶大燕 佘尚揚(yáng) 李穎豐 胡雪樺 馬剛

胎兒先天性心臟畸形（congenital heart defect，CHD）是常見的胎兒結(jié)構(gòu)性異常，發(fā)病率居出生缺陷的首位，也是新生兒和兒童期的主要死亡原因之一[1-4]。CHD的產(chǎn)前診斷目前主要依賴于超聲心動(dòng)圖檢查，診斷胎兒CHD并明確其分子遺傳機(jī)制可為后續(xù)相應(yīng)干預(yù)提供依據(jù)，對(duì)

降低心臟缺陷胎兒出生率、疾病的遺傳咨詢等具有重要的臨床意義。目前關(guān)于CHD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，遺傳因素在CHD的病因?qū)W中占有重要地位，而國(guó)內(nèi)關(guān)于大樣本CHD胎兒的遺傳研究鮮有報(bào)道[1,5-6]。筆者對(duì)172例產(chǎn)前超聲檢查CHD胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)及妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，探討CHD的分子遺傳基礎(chǔ)及妊娠結(jié)局，為臨床處理提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2015年11月至2017年5月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前超聲檢測(cè)診斷為CHD的胎兒172 例，孕婦年齡 18～41（29.6±5.0）歲，孕周 21～38+5（26.8±3.1）周。超聲檢查前孕婦均知情同意。

1.2 儀器和方法 采用奧地利GE Voluson E8型和荷蘭PhiIips IU22彩色多普勒超聲診斷儀，GE Voluson E8二維凸陣探頭頻率為 3.5～5.0MHz或 1～5MHz，Philips IU22三維容積探頭頻率為2～6MHz。

1.2.1 超聲檢查 受檢孕婦取仰臥位，超聲檢查切面包括：側(cè)腦室、丘腦、小腦切面，顏面部冠狀切面，鼻骨矢狀正中切面，眶間距切面，脊柱縱切面，四腔心、左右心室流出道觀、三血管觀，主動(dòng)脈弓切面、導(dǎo)管弓切面，腹圍切面，雙腎橫切面及縱切面，膀胱旁臍動(dòng)脈切面，雙上肢肱骨、尺橈骨、雙下肢股骨、脛腓骨縱切面等；同時(shí)觀察羊水、臍帶及胎盤情況。

1.2.2 染色體核型分析 采集胎兒臍帶血2～4ml、羊水20ml絨毛，采用Lab-Aid DNAIsolation kit試劑盒（廈門致善公司）按照說明書進(jìn)行DNA抽提。將胎兒臍帶血接種于5ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液（廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品），37℃培養(yǎng)72h后進(jìn)行常規(guī)染色體制備、G顯帶分析。無菌條件下接種羊水，37℃細(xì)胞培養(yǎng)，按常規(guī)方法收獲細(xì)胞、制片及核型分析。每例分析5個(gè)核型，計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，嵌合體至少計(jì)數(shù)50個(gè)核型。根據(jù)人類遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN 2009）對(duì)染色體核型命名。染色體數(shù)目異常（如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等）及結(jié)構(gòu)異常（如缺失、重復(fù)、異位等）為檢測(cè)陽性。1.2.3 基因芯片檢測(cè) 根據(jù)Human Cyto SNP-12微陣列芯片（美國(guó)Illumina公司）標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Illumina iscan進(jìn)行芯片掃描、GenomeStudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。通過查閱常用數(shù)據(jù)庫（Clingen、C1inVar、DECIPHER、DGV和OMIM等）及PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫對(duì)檢出拷貝數(shù)變異（copy-number variations，CNVs）的致病性進(jìn)行判讀分析，以上數(shù)據(jù)庫定義為致病性或可疑致病性CNVs為檢測(cè)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室病因檢測(cè)核型分析及芯片檢測(cè)結(jié)果 172例CHD胎兒經(jīng)染色體核型和芯片檢測(cè)，62例為陽性，其陽性檢出率達(dá)36.0%，其中染色體數(shù)目異常51例，以18-三體綜合征（20例）、13-三體綜合征（15例）和21-三體綜合征（14例）為主，還有特納綜合征1例和9號(hào)染色體三體1例；染色體結(jié)構(gòu)異常6例（表1），5例檢測(cè)有致病性CNVs（表2），其中有3例為22q11微缺失綜合征；剩余110例未見上述實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)異常。

表1 染色體結(jié)構(gòu)異常的6例CHD胎兒B超檢查結(jié)果

表2 基因芯片檢測(cè)陽性5例CHD胎兒B超檢查結(jié)果

2.2 胎兒心臟超聲檢查結(jié)果 本組172例胎兒按心內(nèi)畸形的復(fù)雜程度及對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響，分為簡(jiǎn)單型CHD 58例，檢出核型或芯片異常10例，陽性檢出率為17.2%；復(fù)雜型CHD 114例，檢出核型或芯片異常52例，陽性檢出率為45.6%，簡(jiǎn)單型與復(fù)雜型陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.4，P＜0.05）；按是否合并心外畸形，分為無心外畸形101例，合并心外畸形71例，各類型畸形病因?qū)W分布見表3、4。CHD畸形類型以室間隔缺損（51.7%，89/172）、永存左上腔靜脈（13.4%，23/172）、心內(nèi)膜墊缺損（10.5%，18/172）、單臍動(dòng)脈（9.9%，17/172）和右位主動(dòng)脈弓（8.7%，15/172）5種類型最為常見。

表3 不同類型CHD胎兒染色體及基因異常檢出情況（例）

表4 是否合并心外畸形CHD胎兒染色體及基因CNVs異常檢出情況（例）

2.3 妊娠結(jié)局 實(shí)驗(yàn)室檢出陽性胎兒62例，全部引產(chǎn)，剩余110例未見異常者，其中23例直接引產(chǎn)，絕大多數(shù)引產(chǎn)兒檢出有無法根治或預(yù)后不良的心臟畸形（單心室，左或右心室發(fā)育不良，法洛四聯(lián)癥等）或伴有其他系統(tǒng)畸形；45例輕型或可根治的心臟畸形選擇繼續(xù)妊娠（其中41例出生后未見明顯異常，宮內(nèi)感染出生后死亡1例，肺炎患兒出生2d夭折1例，肌張力低1例，新生兒室缺1例）；剩余42例妊娠結(jié)局尚且待定。

3 討論

CHD是常見的先天畸形，已成為嬰幼兒死亡和致殘的主要病因之一[7-8]。產(chǎn)前明確診斷胎兒心臟畸形，依據(jù)病情、進(jìn)行宮內(nèi)治療、制定出生后救治方案或終止妊娠等相應(yīng)處理，對(duì)降低出生缺陷和心臟畸形兒圍生期病死率有重要作用[9-11]。本研究對(duì)172例CHD胎兒產(chǎn)前超聲圖像特征進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)CHD胎兒畸形類型主要以室間隔缺損和永存左上腔靜脈最常見，分別占51.7%和13.4%。而Wei等[12]檢測(cè)西安CHD胎兒畸形類型以單心室（15.9%）和室間隔缺損（12.3%）為主。

心臟的發(fā)育過程涉及細(xì)胞遷移、心臟血流動(dòng)力學(xué)的形成、部分心肌細(xì)胞定向生長(zhǎng)和細(xì)胞定植等多個(gè)過程，其中任一過程受到影響都可能引起心臟發(fā)育異常。目前已知可導(dǎo)致CHD的因素主要有兩類：遺傳基因因素（染色體異常、基因突變）和與母親相關(guān)的危險(xiǎn)因素（包括風(fēng)疹病毒及其他感染、輻射、用藥和環(huán)境污染等）[13-15]。但大多數(shù)CHD的病因尚不明確，目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用染色體核型和基因芯片技術(shù)對(duì)大樣本CHD胎兒進(jìn)行遺傳檢測(cè)的研究鮮有報(bào)道。本研究通過聯(lián)合采用染色體核型和基因芯片對(duì)172例CHD胎兒進(jìn)行檢測(cè)，36.0%的CHD胎兒具有陽性遺傳學(xué)檢出結(jié)果，其中29.7%（51/172）的CHD胎兒由于染色體數(shù)目異常所導(dǎo)致，主要以18-三體綜合征、13-三體綜合征和21-三體綜合征為主，表明染色體數(shù)目異常是本地區(qū)CHD胎兒的重要遺傳因素。58例簡(jiǎn)單型CHD胎兒，有10例檢出有核型或芯片異常，陽性檢出率為17.2%；114例復(fù)雜型CHD胎兒，有52例檢出有核型或芯片異常，陽性檢出率為45.6%，其陽性檢出率明顯高于單純CHD胎兒（P＜0.05）。本研究表明，當(dāng)胎兒超聲出現(xiàn)兩個(gè)及以上心臟異常指針時(shí)，其提示出現(xiàn)染色體異常的概率更大，預(yù)后更差。

本研究另外檢出CNVs5例，其中22q11微缺失綜合征3例，患兒典型臨床表現(xiàn)為CHD、腭裂、面部畸形、學(xué)習(xí)障礙、免疫缺陷、行為異常等。22q11微缺失為常見的基因組異常綜合征，其與DiGeorge綜合征（DGS）和腭-心-面綜合征（VCFS）密切相關(guān)[16-18]。22q11區(qū)域因存在低拷貝重復(fù)序列（LCRs），易發(fā)生染色體的不等交換重排，引起基因拷貝數(shù)變異。目前可將22q11微缺失分為近端，中端和遠(yuǎn)端 CNVs三個(gè)部分，TBX1、CRKL和MAPK1基因分別是近端，中端和遠(yuǎn)端22q11微缺失中導(dǎo)致CHD的關(guān)鍵基因，其致病機(jī)制與缺失片段中的關(guān)鍵基因單倍體劑量不足相關(guān)。LCR22-A至LCR22-D區(qū)域缺失是目前已知的導(dǎo)致心臟畸形發(fā)生常見的遺傳因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)的3例22q11微缺失綜合征，均位于LCR22-A至LCR22-D區(qū)域內(nèi)，其缺失片段大小在2.6～3.0Mb。目前的核型分析和染色體顯帶技術(shù)一般只能檢測(cè)＞10Mb的片段缺失和重復(fù)，其分辨率無法檢測(cè)微小片段的結(jié)構(gòu)變異。作為新的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)手段，SNP-array可在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色體缺失和重復(fù)，并能準(zhǔn)確測(cè)定其大小。相對(duì)傳統(tǒng)核型技術(shù)，基因芯片具有分辨率高、檢測(cè)時(shí)間短、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)；此外，芯片技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)基因組中存在的片段純合區(qū)（absence of Heterozygosity，AOH）和單親二倍體（uniparental disomy，UPD）。但相對(duì)于核型分析染色體顯帶技術(shù)，芯片技術(shù)也存在自身的缺陷：不能檢測(cè)平衡易位，也不能檢測(cè)倒置，故兩者可相互彌補(bǔ)，將兩種技術(shù)結(jié)合起來可極大提高檢出率。

復(fù)雜多發(fā)心臟畸形因影響生活質(zhì)量預(yù)后差，但輕型法洛四聯(lián)癥等畸形手術(shù)效果好預(yù)后也好。雖然絕大部分染色體數(shù)目異常導(dǎo)致胎兒復(fù)雜CHD伴心外畸形，但也有少數(shù)染色體數(shù)目異常胎兒B超檢查僅表現(xiàn)為輕型心臟畸形而被醫(yī)務(wù)人員和患者忽略，此時(shí)遺傳學(xué)檢測(cè)就顯得尤為重要。同時(shí)很多經(jīng)核型檢測(cè)，芯片檢測(cè)均為陰性的胎兒表現(xiàn)為復(fù)雜CHD伴其他心外畸形，這些胎兒為其他引起CHD基因的研究提供了重要線索。B超檢測(cè)聯(lián)合遺傳學(xué)檢測(cè)可為胎兒心臟畸形和心外畸形提供診斷，為孕婦合理的選擇提供幫助，既可避免不必要的引產(chǎn)，同時(shí)也能彌補(bǔ)單一B超檢測(cè)所引起的漏診和誤診。

綜上所述，本研究通過對(duì)172例CHD胎兒進(jìn)行核型分析和基因芯片檢測(cè)，共檢出62例致病性染色體異常，檢出率達(dá)36%。產(chǎn)前超聲聯(lián)合遺傳學(xué)分析可早期發(fā)現(xiàn)胎兒CHD，對(duì)降低先天畸形胎兒出生率及指導(dǎo)臨床診斷治療等處理具有重要意義。