李小妹 付春云 龍喜貴 王立芳 蒙達(dá)華 曾尚娟 莫梅珍 王張紅羅仕玉 李奇霏 黃麗利 聶大燕 佘尚揚(yáng) 李穎豐 胡雪樺 馬剛
胎兒先天性心臟畸形(congenital heart defect,CHD)是常見的胎兒結(jié)構(gòu)性異常,發(fā)病率居出生缺陷的首位,也是新生兒和兒童期的主要死亡原因之一[1-4]。CHD的產(chǎn)前診斷目前主要依賴于超聲心動(dòng)圖檢查,診斷胎兒CHD并明確其分子遺傳機(jī)制可為后續(xù)相應(yīng)干預(yù)提供依據(jù),對(duì)
降低心臟缺陷胎兒出生率、疾病的遺傳咨詢等具有重要的臨床意義。目前關(guān)于CHD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,遺傳因素在CHD的病因?qū)W中占有重要地位,而國(guó)內(nèi)關(guān)于大樣本CHD胎兒的遺傳研究鮮有報(bào)道[1,5-6]。筆者對(duì)172例產(chǎn)前超聲檢查CHD胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)及妊娠結(jié)局進(jìn)行分析,探討CHD的分子遺傳基礎(chǔ)及妊娠結(jié)局,為臨床處理提供依據(jù)。
1.1 對(duì)象 選擇2015年11月至2017年5月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前超聲檢測(cè)診斷為CHD的胎兒172 例,孕婦年齡 18~41(29.6±5.0)歲,孕周 21~38+5(26.8±3.1)周。超聲檢查前孕婦均知情同意。
1.2 儀器和方法 采用奧地利GE Voluson E8型和荷蘭PhiIips IU22彩色多普勒超聲診斷儀,GE Voluson E8二維凸陣探頭頻率為 3.5~5.0MHz或 1~5MHz,Philips IU22三維容積探頭頻率為2~6MHz。
1.2.1 超聲檢查 受檢孕婦取仰臥位,超聲檢查切面包括:側(cè)腦室、丘腦、小腦切面,顏面部冠狀切面,鼻骨矢狀正中切面,眶間距切面,脊柱縱切面,四腔心、左右心室流出道觀、三血管觀,主動(dòng)脈弓切面、導(dǎo)管弓切面,腹圍切面,雙腎橫切面及縱切面,膀胱旁臍動(dòng)脈切面,雙上肢肱骨、尺橈骨、雙下肢股骨、脛腓骨縱切面等;同時(shí)觀察羊水、臍帶及胎盤情況。
1.2.2 染色體核型分析 采集胎兒臍帶血2~4ml、羊水20ml絨毛,采用Lab-Aid DNAIsolation kit試劑盒(廈門致善公司)按照說明書進(jìn)行DNA抽提。將胎兒臍帶血接種于5ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液(廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品),37℃培養(yǎng)72h后進(jìn)行常規(guī)染色體制備、G顯帶分析。無菌條件下接種羊水,37℃細(xì)胞培養(yǎng),按常規(guī)方法收獲細(xì)胞、制片及核型分析。每例分析5個(gè)核型,計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相,嵌合體至少計(jì)數(shù)50個(gè)核型。根據(jù)人類遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 2009)對(duì)染色體核型命名。染色體數(shù)目異常(如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等)及結(jié)構(gòu)異常(如缺失、重復(fù)、異位等)為檢測(cè)陽性。1.2.3 基因芯片檢測(cè) 根據(jù)Human Cyto SNP-12微陣列芯片(美國(guó)Illumina公司)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),應(yīng)用Illumina iscan進(jìn)行芯片掃描、GenomeStudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。通過查閱常用數(shù)據(jù)庫(Clingen、C1inVar、DECIPHER、DGV和OMIM等)及PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫對(duì)檢出拷貝數(shù)變異(copy-number variations,CNVs)的致病性進(jìn)行判讀分析,以上數(shù)據(jù)庫定義為致病性或可疑致病性CNVs為檢測(cè)陽性。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,陽性率比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 實(shí)驗(yàn)室病因檢測(cè)核型分析及芯片檢測(cè)結(jié)果 172例CHD胎兒經(jīng)染色體核型和芯片檢測(cè),62例為陽性,其陽性檢出率達(dá)36.0%,其中染色體數(shù)目異常51例,以18-三體綜合征(20例)、13-三體綜合征(15例)和21-三體綜合征(14例)為主,還有特納綜合征1例和9號(hào)染色體三體1例;染色體結(jié)構(gòu)異常6例(表1),5例檢測(cè)有致病性CNVs(表2),其中有3例為22q11微缺失綜合征;剩余110例未見上述實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)異常。
表1 染色體結(jié)構(gòu)異常的6例CHD胎兒B超檢查結(jié)果
表2 基因芯片檢測(cè)陽性5例CHD胎兒B超檢查結(jié)果
2.2 胎兒心臟超聲檢查結(jié)果 本組172例胎兒按心內(nèi)畸形的復(fù)雜程度及對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響,分為簡(jiǎn)單型CHD 58例,檢出核型或芯片異常10例,陽性檢出率為17.2%;復(fù)雜型CHD 114例,檢出核型或芯片異常52例,陽性檢出率為45.6%,簡(jiǎn)單型與復(fù)雜型陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.4,P<0.05);按是否合并心外畸形,分為無心外畸形101例,合并心外畸形71例,各類型畸形病因?qū)W分布見表3、4。CHD畸形類型以室間隔缺損(51.7%,89/172)、永存左上腔靜脈(13.4%,23/172)、心內(nèi)膜墊缺損(10.5%,18/172)、單臍動(dòng)脈(9.9%,17/172)和右位主動(dòng)脈弓(8.7%,15/172)5種類型最為常見。
表3 不同類型CHD胎兒染色體及基因異常檢出情況(例)
表4 是否合并心外畸形CHD胎兒染色體及基因CNVs異常檢出情況(例)
2.3 妊娠結(jié)局 實(shí)驗(yàn)室檢出陽性胎兒62例,全部引產(chǎn),剩余110例未見異常者,其中23例直接引產(chǎn),絕大多數(shù)引產(chǎn)兒檢出有無法根治或預(yù)后不良的心臟畸形(單心室,左或右心室發(fā)育不良,法洛四聯(lián)癥等)或伴有其他系統(tǒng)畸形;45例輕型或可根治的心臟畸形選擇繼續(xù)妊娠(其中41例出生后未見明顯異常,宮內(nèi)感染出生后死亡1例,肺炎患兒出生2d夭折1例,肌張力低1例,新生兒室缺1例);剩余42例妊娠結(jié)局尚且待定。
CHD是常見的先天畸形,已成為嬰幼兒死亡和致殘的主要病因之一[7-8]。產(chǎn)前明確診斷胎兒心臟畸形,依據(jù)病情、進(jìn)行宮內(nèi)治療、制定出生后救治方案或終止妊娠等相應(yīng)處理,對(duì)降低出生缺陷和心臟畸形兒圍生期病死率有重要作用[9-11]。本研究對(duì)172例CHD胎兒產(chǎn)前超聲圖像特征進(jìn)行總結(jié),發(fā)現(xiàn)CHD胎兒畸形類型主要以室間隔缺損和永存左上腔靜脈最常見,分別占51.7%和13.4%。而Wei等[12]檢測(cè)西安CHD胎兒畸形類型以單心室(15.9%)和室間隔缺損(12.3%)為主。
心臟的發(fā)育過程涉及細(xì)胞遷移、心臟血流動(dòng)力學(xué)的形成、部分心肌細(xì)胞定向生長(zhǎng)和細(xì)胞定植等多個(gè)過程,其中任一過程受到影響都可能引起心臟發(fā)育異常。目前已知可導(dǎo)致CHD的因素主要有兩類:遺傳基因因素(染色體異常、基因突變)和與母親相關(guān)的危險(xiǎn)因素(包括風(fēng)疹病毒及其他感染、輻射、用藥和環(huán)境污染等)[13-15]。但大多數(shù)CHD的病因尚不明確,目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用染色體核型和基因芯片技術(shù)對(duì)大樣本CHD胎兒進(jìn)行遺傳檢測(cè)的研究鮮有報(bào)道。本研究通過聯(lián)合采用染色體核型和基因芯片對(duì)172例CHD胎兒進(jìn)行檢測(cè),36.0%的CHD胎兒具有陽性遺傳學(xué)檢出結(jié)果,其中29.7%(51/172)的CHD胎兒由于染色體數(shù)目異常所導(dǎo)致,主要以18-三體綜合征、13-三體綜合征和21-三體綜合征為主,表明染色體數(shù)目異常是本地區(qū)CHD胎兒的重要遺傳因素。58例簡(jiǎn)單型CHD胎兒,有10例檢出有核型或芯片異常,陽性檢出率為17.2%;114例復(fù)雜型CHD胎兒,有52例檢出有核型或芯片異常,陽性檢出率為45.6%,其陽性檢出率明顯高于單純CHD胎兒(P<0.05)。本研究表明,當(dāng)胎兒超聲出現(xiàn)兩個(gè)及以上心臟異常指針時(shí),其提示出現(xiàn)染色體異常的概率更大,預(yù)后更差。
本研究另外檢出CNVs5例,其中22q11微缺失綜合征3例,患兒典型臨床表現(xiàn)為CHD、腭裂、面部畸形、學(xué)習(xí)障礙、免疫缺陷、行為異常等。22q11微缺失為常見的基因組異常綜合征,其與DiGeorge綜合征(DGS)和腭-心-面綜合征(VCFS)密切相關(guān)[16-18]。22q11區(qū)域因存在低拷貝重復(fù)序列(LCRs),易發(fā)生染色體的不等交換重排,引起基因拷貝數(shù)變異。目前可將22q11微缺失分為近端,中端和遠(yuǎn)端 CNVs三個(gè)部分,TBX1、CRKL和MAPK1基因分別是近端,中端和遠(yuǎn)端22q11微缺失中導(dǎo)致CHD的關(guān)鍵基因,其致病機(jī)制與缺失片段中的關(guān)鍵基因單倍體劑量不足相關(guān)。LCR22-A至LCR22-D區(qū)域缺失是目前已知的導(dǎo)致心臟畸形發(fā)生常見的遺傳因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)的3例22q11微缺失綜合征,均位于LCR22-A至LCR22-D區(qū)域內(nèi),其缺失片段大小在2.6~3.0Mb。目前的核型分析和染色體顯帶技術(shù)一般只能檢測(cè)>10Mb的片段缺失和重復(fù),其分辨率無法檢測(cè)微小片段的結(jié)構(gòu)變異。作為新的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)手段,SNP-array可在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色體缺失和重復(fù),并能準(zhǔn)確測(cè)定其大小。相對(duì)傳統(tǒng)核型技術(shù),基因芯片具有分辨率高、檢測(cè)時(shí)間短、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì);此外,芯片技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)基因組中存在的片段純合區(qū)(absence of Heterozygosity,AOH)和單親二倍體(uniparental disomy,UPD)。但相對(duì)于核型分析染色體顯帶技術(shù),芯片技術(shù)也存在自身的缺陷:不能檢測(cè)平衡易位,也不能檢測(cè)倒置,故兩者可相互彌補(bǔ),將兩種技術(shù)結(jié)合起來可極大提高檢出率。
復(fù)雜多發(fā)心臟畸形因影響生活質(zhì)量預(yù)后差,但輕型法洛四聯(lián)癥等畸形手術(shù)效果好預(yù)后也好。雖然絕大部分染色體數(shù)目異常導(dǎo)致胎兒復(fù)雜CHD伴心外畸形,但也有少數(shù)染色體數(shù)目異常胎兒B超檢查僅表現(xiàn)為輕型心臟畸形而被醫(yī)務(wù)人員和患者忽略,此時(shí)遺傳學(xué)檢測(cè)就顯得尤為重要。同時(shí)很多經(jīng)核型檢測(cè),芯片檢測(cè)均為陰性的胎兒表現(xiàn)為復(fù)雜CHD伴其他心外畸形,這些胎兒為其他引起CHD基因的研究提供了重要線索。B超檢測(cè)聯(lián)合遺傳學(xué)檢測(cè)可為胎兒心臟畸形和心外畸形提供診斷,為孕婦合理的選擇提供幫助,既可避免不必要的引產(chǎn),同時(shí)也能彌補(bǔ)單一B超檢測(cè)所引起的漏診和誤診。
綜上所述,本研究通過對(duì)172例CHD胎兒進(jìn)行核型分析和基因芯片檢測(cè),共檢出62例致病性染色體異常,檢出率達(dá)36%。產(chǎn)前超聲聯(lián)合遺傳學(xué)分析可早期發(fā)現(xiàn)胎兒CHD,對(duì)降低先天畸形胎兒出生率及指導(dǎo)臨床診斷治療等處理具有重要意義。