李小妹 付春云 龍喜貴 王立芳 蒙達華 曾尚娟 莫梅珍 王張紅羅仕玉 李奇霏 黃麗利 聶大燕 佘尚揚 李穎豐 胡雪樺 馬剛

胎兒先天性心臟畸形（congenital heart defect，CHD）是常見的胎兒結(jié)構(gòu)性異常，發(fā)病率居出生缺陷的首位，也是新生兒和兒童期的主要死亡原因之一[1-4]。CHD的產(chǎn)前診斷目前主要依賴于超聲心動圖檢查，診斷胎兒CHD并明確其分子遺傳機制可為后續(xù)相應(yīng)干預(yù)提供依據(jù)，對

降低心臟缺陷胎兒出生率、疾病的遺傳咨詢等具有重要的臨床意義。目前關(guān)于CHD的發(fā)病機制尚不明確，遺傳因素在CHD的病因?qū)W中占有重要地位，而國內(nèi)關(guān)于大樣本CHD胎兒的遺傳研究鮮有報道[1,5-6]。筆者對172例產(chǎn)前超聲檢查CHD胎兒進行遺傳學檢測及妊娠結(jié)局進行分析，探討CHD的分子遺傳基礎(chǔ)及妊娠結(jié)局，為臨床處理提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年11月至2017年5月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前超聲檢測診斷為CHD的胎兒172 例，孕婦年齡 18～41（29.6±5.0）歲，孕周 21～38+5（26.8±3.1）周。超聲檢查前孕婦均知情同意。

1.2 儀器和方法 采用奧地利GE Voluson E8型和荷蘭PhiIips IU22彩色多普勒超聲診斷儀，GE Voluson E8二維凸陣探頭頻率為 3.5～5.0MHz或 1～5MHz，Philips IU22三維容積探頭頻率為2～6MHz。

1.2.1 超聲檢查 受檢孕婦取仰臥位，超聲檢查切面包括：側(cè)腦室、丘腦、小腦切面，顏面部冠狀切面，鼻骨矢狀正中切面，眶間距切面，脊柱縱切面，四腔心、左右心室流出道觀、三血管觀，主動脈弓切面、導管弓切面，腹圍切面，雙腎橫切面及縱切面，膀胱旁臍動脈切面，雙上肢肱骨、尺橈骨、雙下肢股骨、脛腓骨縱切面等；同時觀察羊水、臍帶及胎盤情況。

1.2.2 染色體核型分析 采集胎兒臍帶血2～4ml、羊水20ml絨毛，采用Lab-Aid DNAIsolation kit試劑盒（廈門致善公司）按照說明書進行DNA抽提。將胎兒臍帶血接種于5ml淋巴細胞培養(yǎng)液（廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品），37℃培養(yǎng)72h后進行常規(guī)染色體制備、G顯帶分析。無菌條件下接種羊水，37℃細胞培養(yǎng)，按常規(guī)方法收獲細胞、制片及核型分析。每例分析5個核型，計數(shù)20個中期分裂相，嵌合體至少計數(shù)50個核型。根據(jù)人類遺傳學國際命名體制（ISCN 2009）對染色體核型命名。染色體數(shù)目異常（如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等）及結(jié)構(gòu)異常（如缺失、重復、異位等）為檢測陽性。1.2.3 基因芯片檢測 根據(jù)Human Cyto SNP-12微陣列芯片（美國Illumina公司）標準操作手冊進行實驗，應(yīng)用Illumina iscan進行芯片掃描、GenomeStudio軟件進行數(shù)據(jù)處理。通過查閱常用數(shù)據(jù)庫（Clingen、C1inVar、DECIPHER、DGV和OMIM等）及PubMed文獻數(shù)據(jù)庫對檢出拷貝數(shù)變異（copy-number variations，CNVs）的致病性進行判讀分析，以上數(shù)據(jù)庫定義為致病性或可疑致病性CNVs為檢測陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，陽性率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗室病因檢測核型分析及芯片檢測結(jié)果 172例CHD胎兒經(jīng)染色體核型和芯片檢測，62例為陽性，其陽性檢出率達36.0%，其中染色體數(shù)目異常51例，以18-三體綜合征（20例）、13-三體綜合征（15例）和21-三體綜合征（14例）為主，還有特納綜合征1例和9號染色體三體1例；染色體結(jié)構(gòu)異常6例（表1），5例檢測有致病性CNVs（表2），其中有3例為22q11微缺失綜合征；剩余110例未見上述實驗室檢測異常。

表1 染色體結(jié)構(gòu)異常的6例CHD胎兒B超檢查結(jié)果

表2 基因芯片檢測陽性5例CHD胎兒B超檢查結(jié)果

2.2 胎兒心臟超聲檢查結(jié)果 本組172例胎兒按心內(nèi)畸形的復雜程度及對血流動力學的影響，分為簡單型CHD 58例，檢出核型或芯片異常10例，陽性檢出率為17.2%；復雜型CHD 114例，檢出核型或芯片異常52例，陽性檢出率為45.6%，簡單型與復雜型陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.4，P＜0.05）；按是否合并心外畸形，分為無心外畸形101例，合并心外畸形71例，各類型畸形病因?qū)W分布見表3、4。CHD畸形類型以室間隔缺損（51.7%，89/172）、永存左上腔靜脈（13.4%，23/172）、心內(nèi)膜墊缺損（10.5%，18/172）、單臍動脈（9.9%，17/172）和右位主動脈弓（8.7%，15/172）5種類型最為常見。

表3 不同類型CHD胎兒染色體及基因異常檢出情況（例）

表4 是否合并心外畸形CHD胎兒染色體及基因CNVs異常檢出情況（例）

2.3 妊娠結(jié)局 實驗室檢出陽性胎兒62例，全部引產(chǎn)，剩余110例未見異常者，其中23例直接引產(chǎn)，絕大多數(shù)引產(chǎn)兒檢出有無法根治或預(yù)后不良的心臟畸形（單心室，左或右心室發(fā)育不良，法洛四聯(lián)癥等）或伴有其他系統(tǒng)畸形；45例輕型或可根治的心臟畸形選擇繼續(xù)妊娠（其中41例出生后未見明顯異常，宮內(nèi)感染出生后死亡1例，肺炎患兒出生2d夭折1例，肌張力低1例，新生兒室缺1例）；剩余42例妊娠結(jié)局尚且待定。

3 討論

CHD是常見的先天畸形，已成為嬰幼兒死亡和致殘的主要病因之一[7-8]。產(chǎn)前明確診斷胎兒心臟畸形，依據(jù)病情、進行宮內(nèi)治療、制定出生后救治方案或終止妊娠等相應(yīng)處理，對降低出生缺陷和心臟畸形兒圍生期病死率有重要作用[9-11]。本研究對172例CHD胎兒產(chǎn)前超聲圖像特征進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)CHD胎兒畸形類型主要以室間隔缺損和永存左上腔靜脈最常見，分別占51.7%和13.4%。而Wei等[12]檢測西安CHD胎兒畸形類型以單心室（15.9%）和室間隔缺損（12.3%）為主。

心臟的發(fā)育過程涉及細胞遷移、心臟血流動力學的形成、部分心肌細胞定向生長和細胞定植等多個過程，其中任一過程受到影響都可能引起心臟發(fā)育異常。目前已知可導致CHD的因素主要有兩類：遺傳基因因素（染色體異常、基因突變）和與母親相關(guān)的危險因素（包括風疹病毒及其他感染、輻射、用藥和環(huán)境污染等）[13-15]。但大多數(shù)CHD的病因尚不明確，目前國內(nèi)應(yīng)用染色體核型和基因芯片技術(shù)對大樣本CHD胎兒進行遺傳檢測的研究鮮有報道。本研究通過聯(lián)合采用染色體核型和基因芯片對172例CHD胎兒進行檢測，36.0%的CHD胎兒具有陽性遺傳學檢出結(jié)果，其中29.7%（51/172）的CHD胎兒由于染色體數(shù)目異常所導致，主要以18-三體綜合征、13-三體綜合征和21-三體綜合征為主，表明染色體數(shù)目異常是本地區(qū)CHD胎兒的重要遺傳因素。58例簡單型CHD胎兒，有10例檢出有核型或芯片異常，陽性檢出率為17.2%；114例復雜型CHD胎兒，有52例檢出有核型或芯片異常，陽性檢出率為45.6%，其陽性檢出率明顯高于單純CHD胎兒（P＜0.05）。本研究表明，當胎兒超聲出現(xiàn)兩個及以上心臟異常指針時，其提示出現(xiàn)染色體異常的概率更大，預(yù)后更差。

本研究另外檢出CNVs5例，其中22q11微缺失綜合征3例，患兒典型臨床表現(xiàn)為CHD、腭裂、面部畸形、學習障礙、免疫缺陷、行為異常等。22q11微缺失為常見的基因組異常綜合征，其與DiGeorge綜合征（DGS）和腭-心-面綜合征（VCFS）密切相關(guān)[16-18]。22q11區(qū)域因存在低拷貝重復序列（LCRs），易發(fā)生染色體的不等交換重排，引起基因拷貝數(shù)變異。目前可將22q11微缺失分為近端，中端和遠端 CNVs三個部分，TBX1、CRKL和MAPK1基因分別是近端，中端和遠端22q11微缺失中導致CHD的關(guān)鍵基因，其致病機制與缺失片段中的關(guān)鍵基因單倍體劑量不足相關(guān)。LCR22-A至LCR22-D區(qū)域缺失是目前已知的導致心臟畸形發(fā)生常見的遺傳因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)的3例22q11微缺失綜合征，均位于LCR22-A至LCR22-D區(qū)域內(nèi)，其缺失片段大小在2.6～3.0Mb。目前的核型分析和染色體顯帶技術(shù)一般只能檢測＞10Mb的片段缺失和重復，其分辨率無法檢測微小片段的結(jié)構(gòu)變異。作為新的細胞遺傳學檢測手段，SNP-array可在全基因組范圍內(nèi)檢測染色體缺失和重復，并能準確測定其大小。相對傳統(tǒng)核型技術(shù)，基因芯片具有分辨率高、檢測時間短、自動化程度高等優(yōu)勢；此外，芯片技術(shù)能同時檢測基因組中存在的片段純合區(qū)（absence of Heterozygosity，AOH）和單親二倍體（uniparental disomy，UPD）。但相對于核型分析染色體顯帶技術(shù)，芯片技術(shù)也存在自身的缺陷：不能檢測平衡易位，也不能檢測倒置，故兩者可相互彌補，將兩種技術(shù)結(jié)合起來可極大提高檢出率。

復雜多發(fā)心臟畸形因影響生活質(zhì)量預(yù)后差，但輕型法洛四聯(lián)癥等畸形手術(shù)效果好預(yù)后也好。雖然絕大部分染色體數(shù)目異常導致胎兒復雜CHD伴心外畸形，但也有少數(shù)染色體數(shù)目異常胎兒B超檢查僅表現(xiàn)為輕型心臟畸形而被醫(yī)務(wù)人員和患者忽略，此時遺傳學檢測就顯得尤為重要。同時很多經(jīng)核型檢測，芯片檢測均為陰性的胎兒表現(xiàn)為復雜CHD伴其他心外畸形，這些胎兒為其他引起CHD基因的研究提供了重要線索。B超檢測聯(lián)合遺傳學檢測可為胎兒心臟畸形和心外畸形提供診斷，為孕婦合理的選擇提供幫助，既可避免不必要的引產(chǎn)，同時也能彌補單一B超檢測所引起的漏診和誤診。

綜上所述，本研究通過對172例CHD胎兒進行核型分析和基因芯片檢測，共檢出62例致病性染色體異常，檢出率達36%。產(chǎn)前超聲聯(lián)合遺傳學分析可早期發(fā)現(xiàn)胎兒CHD，對降低先天畸形胎兒出生率及指導臨床診斷治療等處理具有重要意義。