李偉平 吳巍 何衛(wèi)美 吳國棟 朱偉華 左飛 周尾梅 劉江

非酒精性脂肪性肝病現(xiàn)已成為國人嚴(yán)重肝病之一，其包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化、肝硬化等一系列的病理變化。NASH是非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展為肝硬化的限速步驟?！岸未驌簟睂W(xué)說認(rèn)為，胰島素抵抗引發(fā)的第一次打擊導(dǎo)致脂肪變性的肝細(xì)胞對內(nèi)、外源性損害因子的敏感性增強，發(fā)生炎癥和壞死，觸發(fā)二次打擊，使疾病向肝纖維化、肝硬化進(jìn)展[1]。肝臟炎癥是NASH的明顯特征，肝臟免疫應(yīng)答可能在NASH的發(fā)病機制中扮演重要的角色。非酒精性脂肪性肝病患者存在慢性低水平的炎癥，表現(xiàn)為血液循環(huán)中炎癥因子水平升高和局部組織器官炎癥細(xì)胞浸潤，這種炎癥的持續(xù)存在最終導(dǎo)致人體代謝紊亂和器官功能障礙。Treg細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)高水平CD25分子和特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。Treg細(xì)胞主要分泌抗炎癥因子IL-10、IL-35。Th17細(xì)胞是由初始T細(xì)胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子。對乙型肝炎患者的一項研究表明，Treg/Th17比例降低是慢性乙肝炎癥損傷和肝纖維化的促進(jìn)因素[2]。本研究以高脂飲食誘導(dǎo)建立小鼠NASH模型，通過檢測小鼠外周血Treg/Th17比例的變化，探討Treg/Th17對NASH的影響，以期為尋找NASH的新治療靶點提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與動物模型的建立 20只4～6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，體重18～20g。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗，按隨機數(shù)字表法分為模型組和對照組，各10只。對照組小鼠予普通飲食飼養(yǎng)10周。模型組小鼠予高脂飲食飼養(yǎng)10周，高脂飼料s3282購自美國Bioserv公司。10周后處死各小鼠留取外周血與肝組織，以備后序?qū)嶒灐?/p>

1.2 方法

1.2.1 肝組織病理學(xué)檢查 取小鼠肝左葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色與Masson染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。參照美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南[3]，進(jìn)行非酒精性脂肪性肝病活動度評分（NAS）和肝纖維化評分（FibroS），由2位病理科醫(yī)師盲法閱片，取平均值作為最終評分。NAS＞4分視為小鼠NASH模型建立成功。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測 取各小鼠外周血，檢測TG、ALT、AST水平，按檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測，試劑盒均購自南京生物建成有限公司，酶標(biāo)儀檢測。

1.2.3 Treg、Th17細(xì)胞檢測 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Treg、Th17細(xì)胞。常規(guī)分離各小鼠外周血單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 2×107個/ml，與 FITC-CD4+、CD25、Foxp3 4℃避光孵育。PBS洗滌細(xì)胞，1%多聚甲醛懸浮。應(yīng)用FACSVantage流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測，分析采用 CellQuest軟件（美國BD公司），測定CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25 T細(xì)胞中的比例，計算Treg/Th17比例。

1.2.4 肝組織炎癥因子水平檢測 ELISA法檢測小鼠肝組織炎癥因子 NF-κB、IL-6、IL-10、IL-17 的表達(dá)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒均購自上海嵐派生物科技有限公司。取各小鼠的肝組織1～2g，組織均勻混合后抽提組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量檢測。設(shè)空白孔（不加樣品和酶標(biāo)試劑）、不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，再加待測樣品10μl。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，混勻；用封板模封板后37℃溫育30min。揭掉封板模，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復(fù)5次，拍干。然后每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外，每孔先加入顯色液A 50μl，再加入顯色液B50μl，震蕩混勻，37℃避光顯色10min。最后每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品的濃度，即炎癥因子水平。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察并比較模型組與對照組小鼠肝組織病理學(xué)變化；（2）比較兩組小鼠血清TG、ALT、AST水平；（3）比較兩組小鼠外周血 Treg/Th17比例；（4）比較兩組小鼠肝組織炎癥因子水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)變化比較 見圖1（插頁）。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)變化比較（a：HE染色，×200；b：Masson染色，×400）

由圖1可見，對照組小鼠肝組織HE染色與Masson染色顯示肝臟組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，未見到纖維化情況；模型組小鼠肝組織HE染色可見肝細(xì)胞脂肪變性，炎癥細(xì)胞浸潤，氣球樣變性，NAS評分＞4分，NASH模型成功建立，同時Masson染色可見輕、中度竇周纖維化或門靜周圍纖維化。模型組小鼠NAS、FibroS評分均高于與對照組[（4.70±0.82）分vs（0.00±0.00）分、（1.30±0.48）分 vs（0.00±0.00）分，均 P＜0.05]。

2.2 兩組小鼠血清TG、ALT、AST水平比較 見表1。

表1 兩組小鼠血清TG、ALT、AST水平比較

由表1可見，模型組小鼠血清TG、ALT、AST水平均高于對照組（均P＜0.05）。

2.3 兩組小鼠外周血Treg/Th17比例比較 見圖2。

由圖2可見，模型組小鼠外周血Treg/Th17比例較對照組明顯下降（0.72±0.05 vs 2.06±0.15，P＜0.05）。

2.4 兩組小鼠肝組織炎癥因子水平比較 見表2。

由表2可見，與對照組比較，模型組小鼠促炎因子NF-κB、IL-6、IL-17水平均升高（均 P＜0.05），而抗炎因子IL-10水平下降（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)變化比較（a：HE染色，×200；b：Masson染色，×400）

圖2 兩組小鼠外周血Treg、Th17細(xì)胞流式細(xì)胞圖

表2 兩組小鼠肝組織炎癥因子水平比較

3 討論

Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，兩者在功能上相互拮抗，在分化上卻具有相關(guān)性，機體存在Treg/Th17平衡。IL-6能調(diào)控Treg/Th17的平衡，IL-6在轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）存在的情況下誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，另一方面，TGF-β能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，而IL-6抑制能夠抑制這個過程[4]。Treg/Th17失衡會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。

NF-κB為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，NF-κB被激活會促進(jìn)NASH發(fā)生、發(fā)展。IL-6是肝細(xì)胞刺激因子，誘導(dǎo)急性期反應(yīng)。IL-17是Th17細(xì)胞主要效應(yīng)因子，能有效地介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)。IL-10能夠抑制前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，減輕炎癥。Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的機制主要是分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-35。NASH患者的血清促炎因子TNF-α、IL-6明顯升高，而抗炎因子IL-4、IL-10明顯降低[7]，提示Treg細(xì)胞缺失或功能缺陷在NASH炎癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病小鼠由于氧化應(yīng)激引起Treg細(xì)胞凋亡，減少了肝組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量，減弱了其對炎癥反應(yīng)抑制，Treg細(xì)胞的變化可能是當(dāng)肝臟經(jīng)受二次或三次打擊時，導(dǎo)致單純脂肪肝向NASH轉(zhuǎn)變的機制[8]。

然而，單純性脂肪肝進(jìn)展為NASH的研究發(fā)現(xiàn)，肝組織中的CD68+細(xì)胞和Treg細(xì)胞都明顯升高[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，比較代謝異常的胰島素抵抗肥胖者、代謝正常的胰島素抵抗肥胖者以及體型消瘦者的脂肪組織中的T細(xì)胞特征，發(fā)現(xiàn)代謝異常的胰島素抵抗肥胖者脂肪組織中Th17和Th22細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致了引起肝臟代謝功能障礙的細(xì)胞因子產(chǎn)生增加[10]。Th17細(xì)胞和IL-17與肝臟脂肪變性和NASH的促炎反應(yīng)以及促進(jìn)單純性脂肪肝進(jìn)展為NASH等過程具有明顯的關(guān)聯(lián)[11]。因此，單純研究Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞在NASH中的變化，難以闡明NASH免疫方面的機制。

對乙型肝炎患者的研究表明，Treg/Th17比例下降是慢性乙型肝炎炎癥損傷和肝纖維化的促進(jìn)因素[2]。同樣，本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠Treg/Th17比例較對照組明顯下降，導(dǎo)致了促炎因子與抗炎因子之間的失衡，促進(jìn)NASH炎癥及肝纖維化進(jìn)展。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸膠囊能夠在一定程度上緩解NASH小鼠炎癥的主要機制是改善Treg/Th17失衡及其相關(guān)的炎癥反應(yīng)[12]。

綜上所述，Treg/Th17失衡參與了高脂誘導(dǎo)的NASH小鼠的發(fā)病機制。Treg/Th17失衡會導(dǎo)致促炎因子與抗炎因子之間的失衡，促進(jìn)NASH炎癥與肝纖維化的形成。其中具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與機制尚需要進(jìn)一步研究，以為NASH治療尋求新的作用靶點。